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Adattamento alla temperatura Prof. Giorgio Sartor Copyright © 2001-2009 by Giorgio Sartor. All rights reserved. Versione 1.1.1 - apr 2009.

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1 Adattamento alla temperatura Prof. Giorgio Sartor Copyright © by Giorgio Sartor. All rights reserved. Versione apr 2009

2 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura2 Pesci antartici Temperatura corporea bassa (–1.7°C) lacqua salata congela a – 1.8°C Solubiltà O 2 0.3% Basso metabolismo Nessun pigmento respiratorio –Risparmio di sintesi proteica Bassa viscosità del sangue –Facile da pompare –Poca spesa energetica

3 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura3 Proprietà colligative delle soluzioni K cr - costante crioscopica, dipende dal solvente i - coefficiente di van tHoff m – molalità im - osmolalità

4 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura4 Ambiente acquatico e temperatura Gli organismi viventi popolano lambiente acquatico con temperature comprese tra –1.9°C (temperatura di congelamento dellacqua marina) e circa 90°C (temperatura di sorgenti termali.

5 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura5 Catalisi enzimatica

6 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura6 Capacità di adattamento alla temperatura Ad una data temperatura solo le molecole che possiedono una energia maggiore dellenergia di attivazione reagiscono Ciò è lorigine delleffetto Q 10.

7 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura7 Q 10 Data una qualunque reazione chimica k 1 rappresenta la costante di velocità della reazione (V = k 1 [A])

8 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura8 Q 10 Se la stessa reazione avviene ad una temperatura di 10°C maggiore, il valore di k 1 varia e Q 10 è il rapporto tra le due costanti.

9 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura9 Q 10 ReazioneQ 10 Temperatura Diffusione1.0320°C Citocromo c Reduttasi <20°C >20°C Piruvato kinasi <25°C >25°C Coagulazione13.860°C

10 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura10 Attività enzimatiche e temperatura Adattamento Tempi brevi: secondi ore Acclimatazione Tempi medi: giorni mesi Evoluzione Tempi lunghi: anni secoli.

11 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura11 Resistenza alle alte temperature: ATPasi delle miofibrille di pesci

12 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura12 Organismi conformi o regolatori Un organismo che si conforma varia il suo stato nello stesso modo con cui variano le condizioni ambientali. Un organismo che regola mantiene costanti (o quasi) il suo ambiente interno anche in seguito a variazioni dellambiente esterno.

13 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura13 Limiti della resistenza Permette il popolamento di nicchie ecologiche. Il valore LD 50 (50% di sopravvissuti di una specie ad un dato tempo) è usato per definire la resistenza ad un particolare stress. In alternativa si definisce il tempo si sopravvivenza per determinare la loro tolleranza allo stress.

14 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura14 Limiti della resistenza I fattori che limitano la sopravvivenza interagiscono tra loro. Labilità di tollerare lo stress cambia con lacclimatazione.

15 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura15 Adattamento Regolato da ormoni o neurotrasmettitori che variano: –lattività o la concentrazione degli enzimi, –la concentrazione di substrati attraverso la stimolazione di attività enzimatiche, –il rifornimento di energia, –lambiente intracellulare in modo da modulare lattività enzimatica. I meccanismi con i quali esplicano queste funzioni sono: –La fosforilazione/defosforilazione –La modulazione allosterica (inibizione o attivazione) –La variazione del pH, concentrazioni di ioni (K +, Ca ++ …) e substrati.

16 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura16 Acclimatazione Alterazione della via metabolica piuttosto che della singola reazione enzimatica. I meccanismi che regolano lacclimatazione di un organismo sono: –Linduzione genica: meccanismi di sintesi e degradazione di proteine –Variazione della popolazione di isoenzimi –Variazione della concentrazione della composizione delle membrane biologiche

17 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura17 Adattamento dellattività enzimatica

18 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura18 Adattamento molecolare Frequenza di isoenzimi in Fundulus heteroclitus

19 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura19 Adattamento dellattività enzimatica Gli enzimi coinvolti nel metabolismo energetico nei pesci tropicali ed in quelli antartici sono molto diversi in termini di attività enzimatica alle stesse temperature.

20 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura20 Adattamento dellattività enzimatica Enzimi in pesci che vivono in differenti ambienti si sono adattati per avere valori simili di Km a temperature molto diverse

21 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura21 Adattamento della composizione delle membrane biologiche

22 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura22 Omeoviscosità delle membrane biologiche Le proprietà fisiche delle membrane biologiche dipendono dalla classe di lipidi (in termini di catena laterale) e dalla loro concentrazione. In particolare la fluidità (proprietà dipendente dalla temperatura) può regolare molte attività enzimatiche che avvengono a livello delle membrane biologiche

23 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura23 Omeoviscosità delle membrane biologiche A basse temperature le membrane cellulari si arricchiscono in acidi grassi insaturi

24 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura24 Omeoviscosità delle membrane biologiche Varia la fluidità, misurata come polarizzazione di fluorescenza di sonde di membrana.

25 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura25 Omeoviscosità delle membrane biologiche E varia la fluidità, misurata come polarizzazione di fluorescenza di sonde di membrana. Difenilesatriene (DPH

26 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura26 I mari Il mare antartico mantiene una temperatura inferiore a -1° C per tutto lanno. Contiene 274 specie conosciute di pesci 95 delle quali sono Perciformi del subordine dei nototenioidei. Nel mare artico le temperature invernali possono scendere anche al di sotto di –1.8°C. In estate la temperature arriva fino a 7°C.

27 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura27 ANTARTIDE

28 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura28 ARTIDE

29 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura29 Proprietà colligative delle soluzioni K cr - costante crioscopica, dipende dal solvente i - coefficiente di van tHoff m – molalità im - osmolalità

30 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura30 Come fanno i pesci a sopravvivere? Per gli animali sono più pericolosi i cristalli di ghiaccio che non le temperature al di sotto del congelamento. –Quando un animale congela i cristalli di ghiaccio crescono RAPIDAMENTE danneggiando i tessuti. –I cristalli si formano su nuclei di accrescimento nei fluidi extra ed intracellulari –Per evitare danni è necessario che i cristalli crescano LENTAMENTE anche a temperature al di sotto del punto di congelamento.

31 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura31 Come fanno i pesci a sopravvivere? Per gli animali sono più pericolosi i cristalli di ghiaccio che non le temperature al di sotto del congelamento. –In alcuni invertebrati è presente una Ice Nucleting Protein (glicosilata) che permette la crescita di PICCOLI cristalli extracellulari LENTAMENTE aumenta la concentrazione dei soluti extracellulari LENTAMENTE le cellule perdono acqua (shrinkage) LENTAMENTE aumenta la concentrazione di soluti con effetto osmotico

32 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura32 Come fanno i pesci a sopravvivere? Superaffreddamento

33 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura33 Come fanno i pesci a sopravvivere? Sintesi di composti crioprotettivi colligativi (concentrazioni 0.2-2M ) –Polialcoli –Glicerolo (C3) –Ribitolo (C5) –Sorbitolo (C6) sono: –Metabolicamente inerti –Non tossici –Intermedi di vie metaboliche Sintesi di composti crioprotettivi non colligativi (concentrazione minore di 0.2M) –Trealosio (1C6-1C6) –Si lega alle membrane al posto dellacqua

34 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura34 Come fanno i pesci a sopravvivere? Sintesi di composti crioprotettivi colligativi (concentrazioni 0.2-2M ) –Polialcoli –Glicerolo (C3) –Ribitolo (C5) –Sorbitolo (C6) sono: –Metabolicamente inerti –Non tossici –Intermedi di vie metaboliche Sintesi di composti crioprotettivi non colligativi (concentrazione minore di 0.2M) –Trealosio (1C6-1C6) –Si lega alle membrane al posto dellacqua

35 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura35 Come fanno i pesci a sopravvivere? Sintesi di composti crioprotettivi colligativi (concentrazioni 0.2-2M ) –Polialcoli –Glicerolo (C3) –Ribitolo (C5) –Sorbitolo (C6) sono: –Metabolicamente inerti –Non tossici –Intermedi di vie metaboliche Sintesi di composti crioprotettivi non colligativi (concentrazione minore di 0.2M) –Trealosio (1C6-1C6) –Si lega alle membrane al posto dellacqua

36 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura36 Come fanno i pesci a sopravvivere? Sintesi di composti crioprotettivi colligativi (concentrazioni 0.2-2M ) –Polialcoli –Glicerolo (C3) –Ribitolo (C5) –Sorbitolo (C6) sono: –Metabolicamente inerti –Non tossici –Intermedi di vie metaboliche Sintesi di composti crioprotettivi non colligativi (concentrazione minore di 0.2M) –Trealosio (1C6-1C6) –Si lega alle membrane al posto dellacqua

37 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura37 Come fanno i pesci a sopravvivere? Sintesi di composti crioprotettivi colligativi (concentrazioni 0.2-2M ) –Polialcoli –Glicerolo (C3) –Ribitolo (C5) –Sorbitolo (C6) sono: –Metabolicamente inerti –Non tossici –Intermedi di vie metaboliche Sintesi di composti crioprotettivi non colligativi (concentrazione minore di 0.2M) –Trealosio (1C6-1C6) –Si lega alle membrane al posto dellacqua

38 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura38 Come fanno i pesci a sopravvivere? Sintesi di composti crioprotettivi colligativi (concentrazioni 0.2-2M ) –Polialcoli –Glicerolo (C3) –Ribitolo (C5) –Sorbitolo (C6) sono: –Metabolicamente inerti –Non tossici –Intermedi di vie metaboliche Sintesi di composti crioprotettivi non colligativi (concentrazione minore di 0.2M) –Trealosio (1C6-1C6) –Si lega alle membrane al posto dellacqua

39 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura39 Come fanno i pesci a sopravvivere? Nel 1960 Arthur DeVries scoprì che i nototenoidi sintetizzavano proteine antigelo Fino ad ora sono stati scoperti cinque (sei) tipi di proteine antigelo: –AFGP, –AFP I, –AFP II, –AFP III, –AFP IV. –(AFPP)

40 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura40 Non si gela al polo Sud

41 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura41 Struttura delle proteine antigelo AGFP - Antifreeze Glycoprotein –Un tipo AFP – Antifreeze protein –AFP I, –AFP II, –AFP III, –AFP IV, –AFPP (antifreeze-potentiating protein nuova)

42 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura42 n= 4 to 88 m.w.= 2,600 to 56,000 Da AFGP – Antifreeze Glycoprotein (una famiglia di isoforme)

43 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura43

44 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura44 Proteine antigelo Tipo I: 3-4 kDa Tipo II: ~14 kDa Tipo III: 7 kDa 14 kDa Tipo IV: ~15 kDa

45 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura45 AFP tipo I

46 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura46 AFP tipo II

47 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura47 AFP tipo III

48 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura48 Come funzionano le proteine antigelo Interferiscono con la cristallizzazione del ghiaccio nei tessuti.

49 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura49 Come funzionano le proteine antigelo Sono prodotte dal fegato e secrete nel sangue Le proteine circondano I piccoli cristalli di ghiaccio impedendo la crescita di altro ghiaccio.

50 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura50 Origine delle proteine antigelo Lantartico iniziò a gelare circa14 milioni di anni fa. Il congelamento pose una forte pressione selettiva. Le primeversioni delle AFGP probabilmente furono sintetizzate per prevenire il congelamento dei fluidi intestinali.

51 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura51 Evoluzione convergente delle proteine antigelo Levoluzione delle proteine antigelo non concorda con le relazioni tassonomiche. Si sono evolute molte volte in specie diverse. I nototenioidi antartici (Perciformi) e il merluzzo artico (Gadiformi) contengono proteine antigelo che sono pressoché identiche nella composizione aminoacidica anche se gli ordini si separarono circa 40 milioni di anni fa.

52 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura52 Albero filogenetico delle AFP nei pesci

53 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura53 ProteinaPrecursore/OmologoMeccanismo evolutivo Tipo I AFP ?? Tipo II AFP lectine Duplicazione del dominio Tipo III AFP C-terminale di Acido sialico sintasi Duplicazione del dominio Tipo IV AFP apolipoproteinaDuplicazione del dominio AFPP di Nototenioide Dominio globulare del complemento C1Q Duplicazione del dominio

54 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura54 AFGP Di Nototenioide Antartico serina proteasi Tripsinogeno-like (TLP) Reclutamento del segmento del gene TLP e amplificazione de novo del nono ThrAlaAla elemento codificante AFGP di merluzzo artico ?? (non TLP) ??? ProteinaPrecursore/OmologoMeccanismo evolutivo

55 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura55

56 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura56 Resistenza alle alte temperature Heat-Shock Proteins (HSPs) Questa classe di proteine sono prodotte rapidamente in condizione di elevata temperatura prevengono laggregazione di proteine denaturate e assistono la rinaturazione.

57 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura57 Classificazione delle HSP

58 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura58 Ruolo costitutivo delle HSP Le HSP presenti costitutivamente nelle cellule hanno un ruolo fondamentale nei processi fisiologici di ripiegamento trasferimento e degradazione delle proteine.

59 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura59 Ruolo citoprotettivo delle HSP Il ruolo delle HSP indotte in cellule sottoposte ad insulto è quello di minimizzare i danni arrecati ai processi di: –sintesi, –traslocazione –ripiegamento di proteine cellulari.

60 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura60 Risposta heat shock La risposta heat shock è un evento comune a tutti gli organismi, caratterizzato dallaumentata sintesi di HSP in risposta ad un numero molto elevato di stimoli: –aumento di temperatura, –ipossia, –shock osmotico, –metalli pesanti, ischemia, –invecchiamento –…

61 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura61 Degradazione delle proteine Ci sono tre principali sistemi di degradazione delle proteine (nel muscolo): –Ubiquitina-proteosoma Le proteine sono marcate per la degradazione da unità di ubiquitina. I proteosoma 20S inattivo viene attivato da una proteina regolatrice diventando proteosoma 26S Il proteosoma 26S rompe la proteina in peptidi –I peptidi sono scissi in aminoacidi liberi da altri processi nella cellula –Lisosomi Le proteine entrano nei lisosomi via endocitosi –La catepsina e le proteasi degradano i legami peptidici. –Calpaina Proteasi attivate da calcio nel citosol della cellula –I differenti isomeri sono attivati da differenti concentrazioni di calcio.

62 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura62 Sistema Ubiquitina-proteosoma Ubiquitina: –Le proteine sono marcate per la proteolisi selettiva dallubiquitina, una proteina ubiquitaria altamente conservata. –Si forma un legame isopeptidico tra il carbossiterminale dellubiquitina e un gruppo NH 2 di una lisina della proteina da degradare. Il processo è ATP dipendente. Sono coinvolti tre enzimi (E1, E2 e E3).

63 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura63 Sistema Ubiquitina-proteosoma Inizialmente il carbossiteminale dellubiquitina è legato con un legame tioestere al Ubiquitin-Activating Enzyme (E1) attraverso una reazione ATP dipendente Lubiquitina vien quindi trasferita ad un gruppo sulfidrilico del Ubiquitin-Conjugating Enzyme (E2). Una Ubiquitin-Protein Ligase (E3) trasferisce lubiquitina attivata al gruppo -amino di una lisina formando un legame isopeptidico. Ci sono diverse ligasi dellubiquitina che differiscono per la specificità.

64 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura64 Sistema Ubiquitina-proteosoma H2NH2NCOOH Più ubiquitine sono legate per formare una catena. Il carbossiterminale forma un legame con il gruppo -amino della Lys48 di una catena adiacente di ubiquitina.

65 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura65 Sistema Ubiquitina-proteosoma Alcune proteine (per esempio le cicline, coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare) presentano una sequenza chiamata destruction box, riconosciuta da un dominio del corrispondente E3. Linterazione dellubiquitina ligasi con il suo bersaglio è regolata, in alcuni casi, dalla fosforilazione della proteina bersaglio e può coinvolgere altre proteine adattatrici. H2NH2NCOOH

66 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura66 Sistema Ubiquitina-proteosoma La degradazione selettiva di una proteina avviene nel proteosoma. Un complesso proteico presente nella cellula. Il core complex del proteosoma, ha un coefficiente di sedimentazione di 20S ed è costituito di 14 subunità di due tipi ( 7 7 ). –Le sette subunità formano un anello a struttura cilindrica. –Le sette subunità formano lanello centrale. 7 7 { { 1JD2

67 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura67 Sistema Ubiquitina-proteosoma Il core complex del proteosoma racchiude una cavità fatta di tre compartimenti collegati da uno stretto passaggio. Lattività proteasica è associata a tre delle subunità ognuna con differente specificità per il substrato.

68 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura68 Sistema Ubiquitina-proteosoma 1.Una subunità ha una attività simile alla chimotripsina con preferenza per Tyr o Phe come AA al carbonile del legame peptidico. 2.Una subunità ha una attività simile alla tripsina con preferenza per Arg o Lys al carbonile del legame peptidico. 3.Una subunità ha una attività post-glutamil con preferenza per glutamato o altro residuo acido. Non sono coinvolti residui di cisteina o serina. Lattività idrolasica del proteosoma costituisce una famiglia di proteasi a treonina.

69 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura69 Sistema Ubiquitina-proteosoma Nella struttura del core complex del proteosoma non ci sono apparenti aperture verso lesterno. Si è postulata linterazione con un cap complex che apra il passaggio verso lesterno. È stato cristallizzato il core complex 20S del proteosoma con il cap complex 11S. Linterazione del cap complex 11S altera la conformazione del dominio N-terminale delle subunità del core complex permettendo laccesso dallesterno. 1FNT

70 gs © ver 1.1.1Adattamento alla temperatura70 Referenze sul WEB Vie metaboliche –KEGG: Degradazione degli xenobiotici: Struttura delle proteine: –Protein data bank (Brookhaven): –Hexpasy Expert Protein Analysis System: Prosite (protein families and domains): Enzyme (Enzyme nomenclature database): –Scop (famiglie strutturali): Enzimi: –Nomenclatura - IUBMB: –Proprietà - Brenda: –Expasy (Enzyme nomenclature database): Database di biocatalisi e biodegradazione: Citocromo P450: Metallotioneine: Tossicità degli xenobiotici: Agency for Toxic Substances and Disease Registry

71 Crediti e autorizzazioni allutilizzo Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da: Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto lautore usando questa frase: Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor Università di Bologna a Ravenna Giorgio Sartor -


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