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Acidi nucleici - 1 presentazione del prof. Ciro Formica Ripercorrere le tappe che hanno portato a identificare nel DNA il materiale genetico; gli esperimenti.

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1 Acidi nucleici - 1 presentazione del prof. Ciro Formica Ripercorrere le tappe che hanno portato a identificare nel DNA il materiale genetico; gli esperimenti di Griffith di Avery-McLeod di Hershey e Chase.

2 Prima degli anni 20 2 Erano già stati eseguiti: -gli esperimenti di Mendel nell800 sui piselli -gli esperimenti di Sutton sullappaiamento dei cromosomi omologhi -i primi esperimenti di Morgan sulla Drosophila -lestrazione della nucleina da parte di Miescher Del DNA si conosceva solo che era formato da composti a base di fosfati, ma nulla si sapeva della doppia elica, né che fosse il materiale della trasmissione ereditaria. Gli scienziati erano invece convinti che fossero le proteine a trasmettere linformazione genetica Immagini e testi tratti da: wikipedia.it, unimi.it, genome.wellcome.ac.uk

3 I primi studi di genetica: Mendel 3 Gregor Mendel ( ) fu un abate di origine ceca studioso di matematica e botanica. Oggi è conosciuto come il "padre della genetica moderna. Per i suoi esperimenti coltivò e analizzò durante 7 anni circa piante di piselli. Nei 2 anni successivi elaborò i suoi dati e giunse a 3 formulazioni, che poi diventarono famose come leggi dellereditarietà.

4 I caratteri di Mendel della pianta di pisello 4

5 Scoperta della nucleina: Miescher 5 Friedrich Miescher, biologo svizzero ( ) scoprì nel 1869 la NUCLEINA, una sostanza ricca di fosfato nel nucleo dei globuli bianchi. Fu uno dei primi passi verso la futura scoperta del DNA. Trattando le cellule del pus con la pepsina ottenne dei nucleiche poi trattava con soluzioni debolmente alcaline. Poi neutralizzò con soluzioni acide ottenendo un precipitato insolubile in acqua e in soluzioni saline.

6 La nucleina di Miescher 6 La sostanza che aveva isolato non poteva essere nessuna delle proteine conosciute e fu denominata NUCLEINA. In seguito Altmann eliminò le proteine dalla nucleina. Fu il primo ad usare lespressione ACIDO NUCLEICO Scoperte successive collegate a questa: Kossel basi azotate Levene deossiribosio e tetranucleotide (dati sperimentali errati: credeva che il peso molecolare medio del DNA fosse di circa 1500 dalton compatibile con 4 x 330 dalton, peso medio dei singoli nucleotidi). Laboratorio di Miescher

7 il DNA come macromolecola – P. Levene 7 Phebus Levene biochimico lituano/USA ( ) scoprì che il DNA era composto da nucleotidi ognuno formato da base azotata, fosfato e zuccheri, che isolò per primo. Erroneamente ritenne però che il DNA fosse composto solo da tetranucleotidi A – T –G –C in proporzioni equimolari: (ATGC)n, ed escluse che fosse sede del materiale genetico. Non pensò inoltre che con 4 nucleotidi si possono formare numerose combinazioni (es. ATGC ATCG AGTC AGCT ACGT ACTG ) oltre a quelle con basi ripetute. Si dovette attendere gli anni 40 per lanalisi cromatografica del DNA con cui si scoprirono i veri rapporti percentuali tra le basi

8 Cromosomi omologhi e geni: Sutton 8 Walter Sutton, biologo USA ( ) scoprì nel 1902 insieme a Boveri che durante la meiosi e la mitosi i cromosomi omologhi si appaiano. Ma il suo più importante contributo alla biologia fu la teoria cromosomica dellereditarietà: i cromosomi sono costituiti da unità portatrici dellinformazione ereditaria che vennero definite geni. EVERY student of elementary genetics learns of Walter Sutton. He was the first to point out that chromosomes obey Mendel's rulesthe first clear argument for the chromosome theory of heredity.

9 Le mutazioni: De Vries 9 Hugo de Vries, biologo olandese ( ) introdusse la teoria della mutazione (1903). Riscoprì Mendel e si interessò a Darwin, ma scoprì nelle piante delle variazioni discontinue, e al contrario di Darwin le attribuì alla comparsa di una nuova specie. Definì il processo come una mutazione..

10 Trasmissione caratteri cromosoma X: emofilia 10

11 Gli studi sulla Drosophila: Morgan 11 Thomas H. Morgan, biologo USA ( ) eseguì, a partire dal 1910, fondamentali ricerche sul moscerino della frutta. Grazie ad esse dimostrò localizzazione e ordinamento lineare dei geni sui cromosomi, dopo averne individuato numerosi sui 4 cromosomi di Drosophila. Dimostrò lesistenza delle mutazioni a conferma della teoria cromosomica dell'ereditarietà

12 A partire dagli anni Alcuni scienziati, soprattutto in USA e Gran Bretagna, cominciarono a studiare i batteri. Le motivazioni: -sono diffusi in ogni ambiente, -crescono rapidamente (in media una divisione ogni minuti, -sono invisibili singolarmente, ma si rendono visibili quando si sviluppano le colonie -hanno una struttura apparentemente semplice e agevole da studiare.

13 Dimensioni e crescita delle cellule procarioti 13 Bacilli La crescita batterica è esponenziale: dopo n generazioni ci saranno 2 n batteri. Esempio in 20 generazioni (circa 3 giorni) 2 20 = batteri

14 Frederick Griffith, UK, Medico britannico, lavorando con lo pneumococco (vedi figura) scoprì il principio della trasformazione batterica. Fu una tappa fondamentale nella storia della genetica, in quanto ha fornito le basi biologiche per stabilire che il DNA è il depositario dellinformazione genetica.

15 15 Usò 2 ceppi batterici di Streptococcus pneumoniae (ex Diplococcus pneumoniae), noto come diplococco, batterio sferico che provoca la polmonite: -tipo capsulato, con una capsula polisaccaridica che circonda la parete batterica: coltivato su capsula di Petri forma colonie lisce di tipo S (smooth, liscio). È il ceppo più patogeno perché la capsula protegge il batterio dallattacco del sistema immunitario. -tipo non-capsulato, cioè privo della capsula, forma colonie rugose di tipo R (rough, rugoso). Lassenza della capsula rende lo pneumococco aggredibile dalle difese immunitarie.

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17 17 Ceppo S Ceppo R

18 Esperimento di Griffith,

19 19 Dal sito unive.it

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21 21

22 Oswald Avery, Canada, Medico canadese, visse a lungo negli USA (morì a Nashville, Tennessee, dove negli anni 60 si svolse un famoso raduno rock). Nel 1944 si sapeva che nei cromosomi cera il materiale genetico e che erano formati da nucleoproteine, ovvero molecole contenenti proteine e DNA. All'epoca si credeva che la componente fondamentale del materiale genetico, responsabile della trasmissione dei caratteri ereditari, era costituita dalle proteine poiché i 20 amminoacidi erano un linguaggio più efficace per spiegare la grande variabilità genetica degli esseri viventi rispetto ai soli 4 nucleotidi.

23 Colin Mc Leod, ; Mclyn McCarthy, Mclyn McCarthy, genetista USA. Colin McLeod. Genetista canadese.

24 24 Dagli pneumococchi S virulenti uccisi con il calore furono estratte proteine, lipidi, polisaccaridi e acidi nucleici. Si cercò di capire quale fosse in grado di trasmettere i caratteri ereditari. Per dimostrare che il DNA era effettivamente il principio trasformante furono eseguiti numerosi test biochimici per separare le varie componenti chimiche al fine di testarle separatamente e comprendere quali fossero in grado di trasformare i batteri R non virulenti in batteri S virulenti. Ogni componente veniva aggiunta ai batteri R non virulenti che venivano poi iniettata nella cavia. 1- Proteine – sopravvivenza 2- Lipidi – sopravvivenza 3- Polisaccaridi – sopravvivenza 4- Acidi nucleici – NON sopravvivenza. Ciò significava che erano queste molecole, e quindi il DNA, erano in grado di trasformare i batteri R non virulenti in batteri S virulenti. I batteri estratti dalla cavia erano, a loro volta, in grado di causare la morte di altri topolini. Esperimento di Avery-Mc Leod-McCarthy 1944

25 25 Esperimento di Avery-Mc Leod-McCarthy 1944

26 Avery-Mc Leod-McCarthy 26 Ceppi R e ceppi S

27 27 Trasformazione genetica di una cellula batterica di tipo R mediante acquisizione e ricombinazione di un frammento di cromosoma contenente il gene S Animazione: ceppi R non patogeni, ceppi S patogeni

28 28 trattamenti con gli enzimi RNasi e DNasi

29 Alfred Hershey, USA, Genetista statunitense, premio Nobel per la medicina nel 1969, insieme a Salvador Luria e Max Delbrück, per la scoperta della replicazione dei virus e della loro struttura genica. Insieme a Marta Chase scoprì di che natura era il principio trasformante individuato da Griffith.

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31 Marta Chase, USA, Insieme ad Avery condusse due esperimenti. 1) Preparazione di una coltura di fagi marcati con 35 S (zolfo radioattivo). Lo zolfo è presente solo nel rivestimento proteico ma non nel DNA. 2) altra coltura di fagi marcati con 32 P (fosforo radioattivo), che si trova solo nei nucleotidi del DNA ma non nel rivestimento proteico. Con le due colture di fagi vennero infettate due diverse colonie batteriche di Escherichia coli, cresciute senza sostanze radioattive nel terreno. Il principio trasformante si sarebbe trovato all'interno delle cellule del batterio, dato che il virus le sfrutta per riprodursi. Agitando fortemente le cellule infettate si staccano le teste virali dalle cellule batteriche. Poi la centrifugazione faceva andare sul fondo le teste col DNA e nel sopranatante le proteine.

32 32 Esperimento di Hershey e Chase, 1952

33 33 Marcatura radioattiva con 32 P e 35 P Hershey e Chase incorporarono il 32 P nel DNA e il 35 S nelle proteine in colture separate di fagi. Usarono le diverse colture per infettare indipendentemente colture batteriche. Dopo il tempo sufficiente perché avvenisse linfezione essi centrifugarono per separare le cellule batteriche dal materiale fagico rimasto fuori delle cellule (ghost) e quindi misurarono la radioattività nelle due frazioni. Nei fagi marcati con 32 P la gran parte della radioattività si trovava allinterno delle cellule batteriche il DNA del fago era entrato nella cellula; 32 P veniva anche trovato nella progenie fagica. Nei fagi marcati con 35 S, gran parte della radioattività si trovava nei ghost le proteine fagiche non erano entrate nelle cellule batteriche. Conclusione: il DNA è il materiale ereditario, mentre le proteine sono semplicemente veicoli strutturali che vengono scartati dopo che il DNA virale è stato inserito nella cellula batterica.

34 34 Il fosforo (P) dei nucleotidi

35 35 Lo zolfo (S) negli amminoacidi: metionina e cisteina

36 36 Fago T2: struttura e ciclo

37 37 La radioattività da 32 P fu trovata sulle cellule del fondo, mentre quella da 35 S fu trovata nel soprananante e non era entrata nella cellula. era la prova definitiva che il DNA è il vero materiale genetico della cellula.

38 38 08/presentazione_bonolis.pdf Una galoppata verso la double helix

39 Acidi nucleici - 2 presentazione del prof. Ciro Formica Conoscenza dei dati sperimentali forniti da R. Franklin, M. Wilkins, E. Chargaff che hanno contribuito a scoprire la struttura del DNA Il modello a doppia elica di Watson e Crick Le funzioni del DNA dipendono dalla sua struttura.

40 Erwin Chargaff, Austria, Biochimico austro-statunitense (Impero austro-ungarico, nacque a Czernowitz, che oggi si trova in Ucraina). Emigrò negli USA durante il nazismo e divenne cittadino USA nel 40. Mediante la cromatografia su carta riuscì a separare la molecola del DNA nelle sue basi costituenti a determinare la loro abbondanza relativa. Quindi purine e pirimidine hanno la stessa percentuale, cioè %A+G = % T+C Le ricerche furono fondamentali per conoscere la struttura del DNA.

41 Ricerche di Chargaff, Regole di Chargaff : 1- cè un rapporto 1:1 tra le purine (A+G) e le pirimidine (T+C) contenute nel DNA di una cellula. Il rapporto è costante in tutte le specie, ma per specie diverse le % delle varie basi saranno anch'esse diverse, a causa della diversità delle specie. Vale per ogni genoma, tranne che per quello di mitocondri, cloroplasti e DNA virale a singolo filamento. 2- in una molecola di DNA a doppio filamento: %A = %T, %C = %G %A +G = %C+T %G+C è costante per una stessa specie, ma varia da specie a specie.

42 dati di Chargaff 42 Percentuale di basi azotate nel DNA di varie specie AGCTA/TG/CA+G/C+ T %G+C Uomo31,019,118,431,50,981,041,0037,5 Topo28,621,421,728,41,010,991,0043,1 Drosophila27,322,5 27,60,991,000,9945,0 Mais25,624,524,625,31,011,00 49,9 E. coli26,024,925,223,91,090,991,0450,1

43 Rosalind Franklin, UK, Chimica e fisica britannica, terminò gli studi universitari nel 1941 ma a quell'epoca l'università di Cambridge non rilasciava la laurea alle donne. Studiò dapprima le fibre di carbonio, poi alla fine della Seconda Guerra Mondiale lavorò a Parigi dove si specializzò nella diffrazione dei raggi X, una tecnica che permette di analizzare la struttura di molecole di grandi dimensioni. Riuscì ad ottenere notevoli risultati in questo campo e, proprio per questo, nel 1951 venne invitata a lavorare nel laboratorio di Biofisica del dottor John Ransall, al King's College di Londra, diretto da un altro grande scienziato, Maurice Wilkins.

44 44 Allora non si conosceva ancora la struttura molecolare del DNA, ma grazie ai suoi studi di diffrazione dei raggi X, fu la prima ricercatrice ad ottenere uneccellente fotografia della doppia elica, passata alla storia come foto 51. Fotografare molecole complesse all'epoca era molto difficile e rischioso: poteva richiedere anche 100 ore di esposizione alle radiazioni. A causa della piccola lunghezza donda dei raggi X i cristalli funzionano da reticolo di diffrazione.

45 45 La Franklin ottenne un brillante risultato, nonostante l'ambiente difficile nel quale operò e i rapporti difficili con Maurice Wilkins, che la considerò sempre come una sua assistente e non una scienziata capace. Fu proprio Wilkins a mostrare a Watson la foto 51, senza il permesso della Franklin. Basandosi su questa immagine Francis Crick e James Watson formularono il modello a doppia elica del DNA che noi tutti conosciamo. Il 25 Aprile del 1953, su Nature apparve un articolo dei due ricercatori che mostrava, per la prima volta al mondo, la struttura dell'acido desossiribonucleico; i due scienziati non fecero neppure un accenno alla donna che aveva reso possibile la realizzazione di quel modello

46 46 Morì giovanissima a 38 anni per cancro alle ovaie causato probabilmente dalla notevole esposizione ai raggi X con scarsi dispositivi di protezione e non seppe mai quale importante contributo avesse dato alla doppia elica: According to her biographer, she never knew of the crucial role that her photograph 51 had played in the discovery of the double helix Wilkins, Crick e Watson ricevettero il Nobel nel 1962 ma neanche in quella occasione, 4 anni dopo la morte di Rosalind, fu menzionato l'importante contributo della scienziata alla comprensione della struttura molecolare del DNA. Purtroppo il Nobel può essere assegnato solo a scienziati viventi.

47 Maurice Wilkins, UK, Biofisico britannico (nato in N.Zelanda), fu definito il Terzo uomo della doppia elica. Lavorò anche nel Manhattan Project per costruire la prima bomba atomica della storia. Ottenne la prima immagine ai r.X del DNA dove dimostrò che aveva una forma cristallina regolare. Quando la Franklin si unì al suo gruppo pensò che fosse assegnato a lei lintero progetto, mentre lui la considerava solo unassistente. Da qui nacque lequivoco che compromise in modo irreparabile I loro rapporti.

48 Rosalind Franklins photo Struttura a diffrazione o diffrattogramma ai raggi X del DNA. Al centro-periodo minore 0,34 nm In periferia-periodo maggiore 3,4 nm La molecola del DNA è una fibra cilindrica d= 2 nm con le basi impaccate come una pila di monete e i piani centrali distanziati di 0.34 nm (periodo minore). Un giro dellelica misura 3.4 nm (periodo maggiore), un multiplo di 10 della distanza tra basi contigue. Si ipotizzò dunque che il DNA fosse formato da 2 -3 catene

49 Dati di cristallografia del DNA ai raggi X 49 Dati di FranklinDati di ChargaffDati di Pauling Distanza tra 2 eliche 2 nm In caso di legame purina-purina > 2 nm In caso di legame pirimidina- pirimidina < 2 nm appaiamentoA-T (30%) G-C (20%) deduzione*1*2*3 *1: La distanza di 2 nm è la media tra i valori, quindi si dedusse che a legarsi sono sempre una purina con una pirimidina. *2: i filamenti sono antiparalleli, direzione 5 3, le basi sono complementari e sono unite da 2 legami a idrogeno (A-T) e da 3 legami a idrogeno (G-C). *3: i filamenti formano una spirale, come avviene per le proteine

50 La doppia elica del DNA, aprile Da sinistra: Francis Crick e James Watson nel 1953 davanti al modello di doppia elica

51 Doppia elica 51 Watson e Crick senza fare esperimenti ma con modelli in cartone e fil di ferro combinarono i dati disponibili in un modello di struttura del DNA compatibile con tutti i fatti noti, comprendente tutte le proprietà attese per il materiale genetico. Ipotizzarono che si trattasse di una doppia elica stabilizzata da legami a idrogeno. Crick lesse gli appunti che aveva preso al pub in una conversazione con Chargaff: %A = %T, %C = %G in tutti i DNA. Di quella conversazione Chargaff ricordava un proprio commento two pitchmen in search of a helix…: i due giovanotti gli erano sembrati troppo ambiziosi e troppo ignoranti e confondevano le purine con le pirimidine. La viscosità del DNA diminuisce drasticamente a temperature tra 70° e 80°C, indicando che legami chimici termosensibili, quali i legami-idrogeno, sono importanti per la struttura

52 Doppia elica 52 I legami a idrogeno dovevano perciò legare A con T e G con C, le basi complementari. La larghezza dellelica risultava perciò costante e le basi erano planari e perpendicolari allasse della D.E. Le catene pentoso-fosfato fortemente anioniche si devono trovare allesterno della molecola a contatto con lacqua, mentre le coppie di basi, idrofobiche, si impaccano le une sulle altre al centro della molecola, escludendo lacqua. Ciascuna catena ha una estremità 3 e una estremità 5. Esse sono disposte in modo antiparallelo in quanto i legami fosfodiesterici che uniscono i pentosi contigui hanno polarità opposte. Quindi il 5 di una catena si trova di fronte allestremità 3 di quella opposta. Le due eliche differiscono per polarità, sequenza e composizione in basi, ma sono perfettamente complementari, cioè la sequenza di una catena è completamente determinata da quella della catena opposta

53 53 basi complanari; 3 legami a idrogeno (G-C) e 2 legami (A-T) Modello di replicazione semiconservativa

54 Lalfa elica delle proteine Legame idrogeno

55 55 Lappaiamento corretto è PURINA-PIRIMIDINA: larghezza costante, maggiore stabilità, minori torsioni della D.E. Distanza tra le eliche < 2 nm > 2 nm 2 nm misura giusta

56 doppia elica e basi complementari

57 Linus Pauling, USA, Chimico, pacifista e scrittore USA, vincitore del Nobel 1954 per la chimica delle proteine e del 1962 Nobel per la pace. Scoprì la natura del legame chimico e compilò la scala dellelettronegatività. Dimostrò come cambia la struttura dellemoglobina quando si lega allO 2 e come unemoglobina mutata producesse lanemia falciforme. Studiò anche lattività degli enzimi e la natura planare del legame peptidico. Nei 60 denunciò pubblicamente il rischio di contaminazione da fallout radioattivo in seguito agli esperimenti atomici dellepoca nel Pacifico.

58 James Watson, USA, vivente 58 Watson era un biologo USA che seguì il lavoro di Luria, Nobel 1969 e capo del Phage group. Il DNA era allora considerato uno "stupido tetranucleotide" di supporto strutturale per le proteine, ma Watson conosceva il lavoro di Avery sul DNA come "contenitore" dei geni. Il suo progetto di ricerca prevedeva l'utilizzo di raggi X per inattivare l'attività infettiva dei fagi. Nel 51 conobbe Wilkins a Napoli (Stazione Zoologica) proprio quando stava presentando i dati sulla cristallografia del DNA ai r.X. A Cambridge conobbe Crick e insieme lavorarono alla struttura anche utilizzando i dati di Linus Pauling sulle proteine. Giunsero così a definire la doppia elica nellaprile Fu il primo responsabile del Progetto Genoma Umano, 1990, seguito poi da Collins

59 Francis Crick, UK, Scienziato britannico, scoprì insieme a Watson e Wilkins la D.E. DNA. Lavorò agli studi di diffrazione cristallografica ai r.X e insieme costruirono il modello sulla base di un bozzetto eseguito dalla moglie pittrice di Crick. Successivamente con Brenner cercò di determinare come la sequenza di basi specificasse la sequenza proteica, fino al quando nel 61 dimostrarono che la traduzione implica un codice di 3 nucleotidi. Una curiosità: lordine dei nomi sulla rivista Nature, dove fu pubblicato larticolo della doppia elica nel 53, fu deciso col lancio di una monetina.

60 Le funzioni del DNA dipendono dalla sua struttura 60

61 I legami dei nucleotidi 61 NUCLEOTIDE Base azotata-zucchero: C1 Zucchero-fosfato: C5 LEGAME CON ALTRI NUCLEOTIDI Zucchero-fosfato: C5 col nucleotide precedente C3 col nucleotide successivo Ogni filamento decorre in direzione 5 3

62 62 Caratteristiche della DE: diametro uniforme destrorsa antiparallela basi azotate situate nei solchi minori e maggiori Caratteristiche della doppia elica

63 63 Le bp (basi appaiate) si trovano su piani perpendicolari al lasse della DE. Questa è stabilizzata anche dalle interazioni idrofobiche tra le basi azotate Caratteristiche della doppia elica

64 Appaiamento delle basi del DNA A = T G C T = A A = T C G T C C A G G T A G C T = A C G A = T G C denatured strands hybridized strands Hydrogen bonds C G G C Phosphate-sugar backbone Youtube: Corso citologia-DNA e cromosomi

65 Codice genetico UUU Fenilalanina PHE UCU Serina SER UAU Tiroxina TYR UGU Cisteina CYS UUCUCCUACUGC UUA Leucina LEU UCAUAA STOP UGASTOP UUGUCGUAGUGG Triptofano TRP CUUCCU Prolina PRO CAU Istidina HIS CGU Arginina ARG CUCCCCCACCGC CUACCACAA Glutammina GLN CGA CUGCCGCAGCGG AUU Isoleucina ILE ACU Treonina THR AAU Asparagina ASN AGU Serina SER AUCACCAACAGC AUAACAAAA Lisina LYS AGA Arginina ARG AUG Codone inizio ACGAAGAGG GUU Valina VAL GCU Alanina ALA GAU Ac.Aspartico ASP GGU Glicina GLY GUCGCCGACGGC GUAGCAGAA Ac.glutammico GLU GGA GUGGCGGAGGGG

66 Dalla doppia elica al cromosoma

67 Quadrupla elica? Il Dna nelle cellule umane può assumere anche una forma 'a quadrupla elica', e non solo quella a doppia scoperta proprio 60 anni fa da Watson e Crick con il contributo fondamentale di Rosalind Franklin. Lo ha scoperto Giulia Biffi, una ricercatrice italiana che lavora all'università di Cambridge con uno studio pubblicato dalla rivista Nature Chemistry, che per la prima volta ha isolato questa struttura nelle cellule umane. Le strutture a quadrupla elica erano già state isolate in provetta, ma nessuno era mai riuscito a vederle nelle cellule umane.


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