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La via per accelerare i processi biologici ENZIMI Sono delle proteine altamente specializzare con attività catalitica, accelerano le reazioni chimiche.

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Presentazione sul tema: "La via per accelerare i processi biologici ENZIMI Sono delle proteine altamente specializzare con attività catalitica, accelerano le reazioni chimiche."— Transcript della presentazione:

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2 La via per accelerare i processi biologici

3 ENZIMI Sono delle proteine altamente specializzare con attività catalitica, accelerano le reazioni chimiche rimanendo inalterati al termine della reazione stessa. La loro struttura, come quella delle proteine, è molto complessa e caratterizzata da una ben precisa configurazione tridimensionale con ripiegamenti, rientranze e sporgenze. Il sito attivo dellenzima è un regione (estremamente piccola della molecola) a forma di fessura o di tasca che istaura legami con il substrato. E costituito da pochi residui di amminoacidi con una configurazione spaziale ben definita, complementare a quella del substrato con cui interagisce. Per linterazione enzima substrato è stato suggerito il modello chiave serratura:

4 La maggior parte degli enzimi portano nella loro molecola una parte non proteica. In questo caso lenzima intero prende il nome di oloenzima, la componente proteica di apoenzima, la non proteica di gruppo prostetico Se il gruppo prostetico è facilmente dissociabile dallapoenzima esso prende il nome di coenzima. La nomenclatura e la classificazione degli enzimi si basa sul tipo di reazione catalizzata, si hanno così 6 classi di enzimi: Allinterno delle classi gli enzimi vengono generalmente classificati in base al nome del substrato specifico

5 DIFFERENZE TRA ENZIMI E CATALIZZATORI INORGANICI Gli enzimi si distinguono dai comuni catalizzatori inorganici per le seguenti significative caratteristiche: A differenza dei catalizzatori della chimica inorganica che sono composti molto semplici spesso anche semplici atomi, gli enzimi sono molecole proteiche e, pertanto, espressione dei geni. Sono caratterizzati da un peso molecolare molto alto e da una configurazione tridimensionale piuttosto complessa, articolata nelle quattro strutture proprie delle proteine. Peso molecolare Specificità Diversamente dai catalizzatori inorganici che molto spesso si comportano da pas-partout e catalizzano numerose reazioni anche molto diverse tra loro, gli enzimi sono altamente specifici sia verso il substrato sul quale agiscono, sia verso il tipo di reazione che catalizzano. La maggior parte di enzimi agisce su di un unico substrato o su un numero molto limitato di composti. Potere catalitico Gli enzimi accelerano le reazioni almeno di un milione di volte.

6 ENERGIA DI ATTIVAZIONE Perché una reazione chimica possa avvenire, si devono rompere i legami preesistenti e si devono eventualmente formare nuovi legami. Consideriamo una popolazione di molecole R-X che devono reagire per formare il prodotto R + X -. Affinché una reazione chimica avvenga è necessario: le molecole si urtino urto efficace, nel senso che le molecole che si urtano devono avere un contenuto energetico tale da permettere loro di formare il complesso attivato (R X - ) ad alto contenuto energetico e bassa stabilità. Il livello energetico a cui è localizzato il complesso attivato si chiama stato di transizione. La differenza di energia tra i reagenti e lo stato di transizione viene detta energia di attivazione (Ea). Ea rappresenta quindi una barriera energetica che i reagenti devono superare per trasformarsi nei prodotti.

7 Una reazione chimica può essere accelerata aumentando la temperatura. Infatti aumentando la T aumenta lenergia cinetica delle particelle aumenta il numero degli urti efficaci tra le molecole un maggior numero di particelle, nellunità di tempo, formerà il complesso attivato. Il tutto può essere simpaticamente rappresentato come un sasso (reagente) che per arrivare a valle (prodotto) deve superare la montagna (Ea) Maggiore è il numero di molecole R-X capaci di formare, nellunità di tempo, il complesso attivato maggiore sarà la velocità di reazione. La velocità di reazione è definita come la quantità di sostanza consumata o prodotta nellunità di tempo: v = dc/dT

8 Un altro modo per accelerare una reazione è quello di aggiungere un enzima (E). E si lega alle molecole R-X per formare il complesso attivato (E-R + ---X -) il cui stato di transizione è più basso rispetto a quello della reazione non catalizzata. Così alcune molecole di R-X che prima non erano in grado di reagire, adesso legandosi a E entrano nello stato di transizione (più basso) per formare i prodotti. CATALISI ENZIMATICA Gli Enzimi catalizzano tutte le reazioni che avvengono nellambiente cellulare dove le condizioni di temperatura e concentrazione esistenti comporterebbero tempi di reazione molto lunghi.

9 Come si misura la velocità di una reazione catalizzata La velocità di reazione è definita come la quantità di sostanza consumata o prodotta nellunità di tempo. Un altro modo per esprimere la velocità di una reazione catalizzata è il numero di turnover. Esso indica il numero di molecole di substrato che reagiscono con una sola molecola di enzima nellunità di tempo. La velocità di reazione cambia da enzima ad enzima ed è caratteristica di ognuno di essi. vovo [P] [S] Tempo Concentrazione Andamento nel tempo di una reazione enzimatica misurata come comparsa del prodotto (P) o scomparsa del substrato (S). La linea tratteggiata tangente alla curva rappresenta la velocità iniziale v 0 Allinizio quando è praticamente presente tutto il substrato la velocità segue un andamento rettilineo (v 0 ), a mano a mano che il substrato viene consumato la velocità rallenta fino a raggiungere un plateau quando tutto il substrato è stato convertito in prodotto.

10 La velocità di una reazione catalizzata è influenzata dai seguenti fattori Concentrazione del substrato Concentrazione dellenzima Temperatura pH Inibitori

11 E possibile risalire alla velocità di una reazione enzimatica dallequazione v 0 = Vmax [S] / [S] + Km proposta dai due studiosi Michaelis e Menten. Nellequazione, v è la velocità di reazione, Vmax la velocità massima, [S] la concentrazione del substrato e Km è la costante di Michaelis-Menten. Km corrisponde alla concentrazione di S alla quale la velocità è = Vmax/2 A parità di altre condizioni (temperatura, concentrazione di enzima, pH, ecc.) riportando in grafico la concentrazione di substrato in funzione della v 0 si ottiene una curva iperbolica. Si osserva che, nel primo tratto della curva (rettilineo) la v 0 è direttamente proporzionale alla concentrazione di substrato (aumentando la concentrazione di S aumenta proporzionalmente il numero di molecole che formano il complesso ES). Una volta raggiunta una certa concentrazione di S la v 0 cresce più lentamente fino a raggiungere un valore massimo quando tutto lenzima è saturato dal substrato e pur continuando ad aumentare la concentrazione di S la v 0 rimane costante (Vmax). CONCENTRAZIONE DEL SUBSTRATO

12 A basse concentrazioni di substrato, quando [S] è molto più piccola di Km e quindi trascurabile, si ha v 0 = Vmax [S] / Km cioè, la velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato. Ad alte concentrazioni di substrato, quando [S] è molto più grande di Km, Km diventa trascurabile e si ha v 0 = Vmax, cioè, la velocità è la massima, indipendentemente dalla concentrazione del substrato. I valori di Km variano moltissimo da enzima ad enzima ed esprimono laffinità che lenzima ha per il substrato. Osservando la posizione di Km sul grafico velocità contro concentrazione di substrato, si può notare che se Km è bassa, in ogni istante è necessaria una bassa concentrazione di substrato per saturare metà delle molecole di enzima e questo è segno di alta affinità dellenzima per il substrato, mentre se Km è alta, occorre una più alta concentrazione di substrato per saturare metà delle molecole di enzima in ogni istante e questo vuol dire che lenzima presenta bassa affinità per il substrato. Il valore di Km è indipendente dalla concentrazione dell'enzima e dalla concentrazione del substrato. Vmax [S] v 0 = Km + [S] Equazione di Michaelis-Menten

13 Per un calcolo più accurato della V max e della Km è opportuno trasformare matematicamente lequazione di Michealis-Menten facendo il reciproco di entrambi i lati dellequazione Vmax [S] v 0 = Km + [S] ………… 1 K M 1 V max [S] v0v0 = 1 V max + Si ottiene il grafico dei doppi reciproci (o grafico di Lineweaver-Burk) mediante il quale la curva iperbolica viene convertita in una retta

14 CONCENTRAZIONE DELLENZIMA La velocità iniziale v 0 di una reazione enzimatica è direttamente proporzionale alla concentrazione dellenzima. v0v0 5 Km è indipendente dalla concentrazione dellenzima È quindi possibile misurare lattività di un enzima (cioè la sua concentrazione espressa come unità per volume o per g di peso fresco o secco) mediante una misura della Vo ed in particolare della Vmax. Tali misure si effettuano utilizzando una concentrazione saturante di substrato ( 5 volte la Km quando la v o =Vmax) e monitorando la reazione nei primi minuti, quando tutto il substrato è praticamente disponibile. Unità enzimatica: quantità di enzima capace di trasformare una mole di S in 1 minuto a 25 °C nelle condizioni ottimali del saggio.

15 TEMPERATURA La velocità delle reazioni enzimatiche varia col crescere della temperatura secondo il grafico a campana riportato. Si può osservare che, inizialmente, la velocità cresce al crescere della temperatura, raggiunge un massimo in corrispondenza di una certa temperatura definita ottimale, si riduce, in seguito, per effetto della denaturazione dellenzima. pH Come la variazione della temperatura, in modo un poco più complesso, anche la variazione del pH influenza la velocità delle reazioni enzimatiche. Anche in questo caso, la curva presenta un andamento a campana e lattività enzimatica manifesta un massimo in corrispondenza di un valore definito pH ottimale legato alla natura del substrato.

16 Inibitori In molti casi, molecole specifiche o ioni possono competere con le molecole di substrato nel legarsi con lenzima ed inibire lattività dellenzima. Linibizione può essere irreversibile e reversibile. IRREVERSIBILE E irreversibile quando linibitore si va a legare al sito catalitico dellenzima con un legame molto forte, impedendo laccesso del substrato. I + E EI inattivo Un esempio di inibizione irreversibile è dato dallazione dei gas nervini che bloccano lazione dellenzima acetilcolinesterasi, un enzima che ha un ruolo importantissimo nella trasmissione degli impulsi nervosi. Ki

17 Linibizione reversibile può essere competitiva, quando gli inibitori sono, da un punto di vista chimico, molto simili alle molecole di substrato e si legano agli stessi siti attivi, e non competitiva, quando gli inibitori si legano a siti dellenzima diversi da quelli che legano il substrato e, pertanto, possono legarsi sia allenzima che al complesso ES. REVERSIBILE COMPETITIVA Linibitore possiede una struttura molto simile a quella del substrato la similitudine porta il substrato e linibitore a competere per lo stesso sito attivo dellenzima. Lesito della competizione dipende dalla concentrazione delle due molecole che si contendono il sito attivo Può essere completamente rimossa aumentando notevolmente la concentrazione di substrato Linibitore si lega allenzima in una zona diversa da quella del sito attivo dando luogo al complesso EI inattivo. Il legame dellinibitore deforma la conformazione spaziale dellenzima ed il suo sito catalitico pur potendosi legare al substrato risulta inattivo. NON COMPETITIVA

18 E possibile distinguere la inibizione competitiva da quella non competitiva 1/Vmax In presenza di inibitore per ottenere la stessa velocità di reazione che in sua assenza, è necessario aumentare la concentrazione di substrato. La Vmax rimane invariata (infatti a concentrazione elevata di substrato tutta linibizione viene rimossa) mentre la Km aumenta - 1/Km diminuisce. A qualsiasi concentrazione di substrato la velocità di reazione in presenza di inibitore è sempre minore che in sua assenza. Quindi la Vmax diminuisce 1/Vmax aumenta, mentre la Km rimane costante.

19 Biosensori Dr. Giulia Volpe Prof. Giuseppe Palleschi Dipartimento Scienze e Tecnologie Chimiche Università di Roma Tor Vergata

20 La chimica può essere divisa in 5 grandi aree Chimica analitica Chimica biologica Chimica fisica Chimica inorganica Chimica organica Chimica analitica: Sviluppo di nuovi metodi di analisi Unarea della chimica analitica è la sensoristica: un suo specifico settore è lo sviluppo ed applicazione di sensori chimici, biosensori ed immunosensori per applicazioni nel settore clinico, alimentare ed ambientale.

21 Biosensore Strumento analitico in cui è presente un elemento biologico strettamente connesso o integrato con un trasduttore di segnale. Il materiale biologico è rappresentato da uno o piu enzimi, anticorpi, batteri, cellule, tessuti viventi animali o vegetali che interagiscono con il substrato che si vuole determinare e sono responsabili della specificità del sensore. Linterazione del materiale biologico con lanalita da determinare genera un segnale che può essere di tipo elettrochimico luminoso (biosensori ottici) calorico (biosensori termici) variazione di massa (biosensori piezoelettrici) potenziometrici amperometrici

22 Analyte Biological component Transducer Electronics

23 Biosensori elettrochimici Offrono le migliori garanzie per le applicazioni analitiche in termini di sensibilità, riproducibilità e selettività. Sono relativamente facili da assemblare. Possono essere inseriti in celle a flusso per effettuare misure in continuo at-line, on-line o in-line. I tempi di risposta sono dellordine di qualche minuto. Possono essere miniaturizzati e costruiti come sistemi monouso a prezzi estremamente convenienti.

24 Principio di funzionamento di biosensori elettrochimici Un biosensore elettrochimico è costituito da: trasduttore di segnale elettrochimico; trasduttore di segnale elettrochimico; sistema biologico di vario genere. sistema biologico di vario genere. Laffidabilità di questi biosensori deriva da: materiale biologico (enzima, anticorpo etc.) specifico per la specie che si vuole misurare, materiale biologico (enzima, anticorpo etc.) specifico per la specie che si vuole misurare, elettrodo selettivo per il prodotto elettroattivo. elettrodo selettivo per il prodotto elettroattivo. Applicabilità in matrici sporche dove altri metodi di analisi richiedono lunghi e complicati trattamenti del campione.

25 biosensori potenziometrici che utilizzano elettrodi a gas e ionoselettivi (ISE); biosensori amperometrici basati su elettrodi di platino, oro, grafite, carbone, etc. Biosensori elettrochimici

26 Un ISE è costituito da 2 elettrodi di riferimento posti ai due lati di unopportuna membrana che separa la soluzione contenente lo ione da analizzare da una soluzione interna di riferimento contenente lo stesso ione a concentrazione costante. Ciascun lato della membrana interagisce selettivamente con lo ione (lo scambio più massiccio avviene sul lato della membrana rivolto verso la soluzione più concentrata) e si genera ai due lati della membrana una differenza di potenziale misurata mediante i due elettrodi di riferimento collegati ad un potenziometro. SENSORI POTENZIOMETRICI ISE Es.: Elettrodo a vetro per misura del pH

27 Elettrodi potenziometrici In una misura potenziometrica, la relazione che intercorre tra il potenziale misurato e la concentrazione dellanalita in esame è di tipo logaritmico eq. di Nerst E = K + (RT/nF) Log a i E =differenza di potenziale, K =costante di cella, R =costante dei gas T =temperatura assoluta, n =numero di cariche, F =costante di Faraday a i =attività dello ione Esistono elettrodi ISE per K +, Ca 2+, NH 4 +, NO 3 -, Na +, I - etc. che trovano ampia applicazione nel settore ambientale La misura analitica di questi sensori è compresa nellintervallo di concentrazione – mol/L Alcuni elettrodi iono-selettivi (ISE) a membrana come lelettrodo per la misura del pH, possono essere accoppiati con enzimi (biosensori potenziometrici) capaci di generare o consumare lo ione a cui lelettrodo è sensibile.

28 Sensori amperometrici Una misura amperometrica consiste nel rilevare una corrente che passa tra due elettrodi (uno di lavoro e laltro di riferimento) ai quali è stata applicata una differenza di potenziale costante; i due elettrodi immersi in una soluzione costituiscono una cella elettrochimica. Se in soluzione è presente una specie elettroattiva, si misurerà un passaggio di corrente dovuto alla riduzione o ossidazione della specie stessa allelettrodo di lavoro opportunamente polarizzato ad un prefissato valore di potenziale. La variazione di corrente è linearmente correlata alla variazione di concentrazione della specie da misurare. I sensori amperometri di piu largo impiego sono: elettrodo ad ossigeno, elettrodo ad acqua ossigenata, elettrodi basati su mediatori, elettrodi a NADH. Sono comunemente accoppiati ad enzimi capaci di generare o consumare le specie elettroattive.

29 Elettrodo ad ossigeno Un comune elettrodo ad ossigeno è lelettrodo di Clark: catodo (elettrodo di lavoro) di platino o doro, anodo (elettrodo di riferimento) di Ag/AgCl, separati da una resina epossidica isolata. I due elettrodi sono fissati in un supporto di plastica contenente una soluzione elettrolitica. Il tutto è separato dalla soluzione esterna, in cui verrà addizionato il campione da misurare, da una membrana gas permeabile (membrana di teflon). Lelettrodo di lavoro è mantenuto ad un potenziale di circa -700 mV rispetto allelettrodo dargento ed è posto in intimo contatto con la membrana a gas al fine di ottenere una risposta rapida. In queste condizioni si registra una variazione di corrente dovuta alla riduzione dellossigeno al catodo secondo la seguente reazione: Pt= catodo O 2 + 4H + + 4e - 2 H 2 O mentre allanodo Ag/AgCl 4Ag + 4Cl - 4AgCl + 4e -

30 Elettrodo ad ossigeno Il sensore ad O2 può essere accoppiato con un grande numero di enzimi ossidasi immobilizzati su opportune membrane polimeriche che vengono sovrapposte alla membrana di teflon. Come esempio riportiamo il classico sensore sviluppato da Clark e Lyons nel 1962 con lenzima glucosio ossidasi che catalizza la seguente reazione in due passaggi: Glucosio + Enzina-FAD + H 2 O acido gluconico + Enzima-FADH 2 Enzima-FADH 2 + O 2 H 2 O 2 + Enzima-FAD La corrente dovuta alla riduzione dellossigeno al catodo diminuisce allaumentare della concetrazione di glucosio in soluzione. Se lanalita da misurare non è substrato di unossidasi è possibile utilizzare, in alcuni casi, una sequenza enzimatica che, partendo dallanalita, generi un composto che è substrato di una ossidasi.

31 Rappresentazione schematica di un biosensore ad O 2

32 Sensore ad H 2 O 2 La stessa reazione catalizzata dalla glucosio ossidasi può essere utilizzata per la determinazione del glucosio monitorando la produzione di H 2 O 2 con un sensore specifico per questultima specie. Questo sensore amperometrico ha la stessa configurazione di quello ad ossigeno, in questo caso però la polarità è invertita, mV, e lelettrodo di lavoro di platino funziona da anodo, mentre lelettrodo di riferimento di Ag/AgCl funziona da catodo. La reazione di ossidazione dellacqua ossigenata allanodo è la seguente: H 2 O 2 O 2 +2H + +2e - La membrana gas permeabile dellelettrodo ad O 2 viene sostituita con una membrana di acetato di cellulosa che impedisce il passaggio di composti con peso molecolare superiore a dalton che potrebbero essere elettroattivi o potrebbero avvelenare gli elettrodi. Lenzima è immobilizzato e tenuto il piu vicino possibile allelettrodo di lavoro, quindi lH 2 O 2 che si produce dalla reazione enzimatica diffonde attraverso la barriera di acetato di cellulosa, raggiunge lelettrodo di lavoro e produce un aumento di corrente che è direttamente proporzionale alla concentrazione dellanalita da analizzare.

33 BIOSENSORI ELETTROCHIMICI AMPEROMETRICI O -ring Membrana enzimatica Membrana di acetato di cellulosa Membrana di policarbonato Supporto Elettrodo di riferimento (Ag/AgCl) Elettrodo di lavoro di Pt

34 Sensori basati su mediatori Sensori amperometrici indipendenti dallO 2 utilizzano composti a basso peso molecolare detti mediatori che trasportano elettroni dal centro di ossido- riduzione degli enzimi alla superficie dellelettrodo. Tornando alla reazione catalizzata dalla glucosio ossidasi la riossidazione del FADH 2 viene effettuata dal mediatore secondo la reazione: Enzima-FADH 2 + Med ox Enzima-FAD + Med rid + 2 H + il mediatore ridotto si riossida allelettrodo di lavoro: Med rid Med ox + 2e - La riossidazione del mediatore genera un segnale di corrente che viene registrata da uno strumento connesso agli elettrodi. Nel caso del ferrocene il potenziale al quale avviene lossidazione è <500 mV (vs.Ag/AgCl); tale potenziale è sufficientemente piccolo da evitare significative interferenze da parte di composti elettroattivi che possono essere presenti nel campione. Il mediatore si sostituisce allO 2 in soluzione, e questo, vista la scarsa solubilità dellossigeno in acqua, determina unespansione dellintervallo di linearità della risposta.

35 Elettrodi a NAD(P)H Unaltra classe di sensori amperometrici è rappresentata dagli elettrodi a NAD(P)H. Tali molecole sono coinvolte in molte reazioni che utilizzano enzimi deidrogenasi. Questi cofattori enzimatici in presenza dellenzima e del substrato passano dalla forma ossidata NAD(P) + alla forma ridotta NAD(P)H che viene riossidata: direttamente alla superficie dellelettrodo di lavoro; interagisce con un mediatore secondo lo schema sottoriportato Substrato Prodotto Enzima + NAD(P) + Enzima + NAD(P)H Med. (red) Med. (ox) e-e-

36 IMMOBILIZZAZIONE DEI SISTEMI BIOLOGICI Limmobilizzazione dei sistemi biologici, che ne permette il riutilizzo, può essere di due tipi: fisica, se la proteina è trattenuta fisicamente al supporto; chimica, se tra supporto e proteina si formano veri e propri legami covalenti. Limmobilizzazione fisica comprende le tecniche di intrappolamento in gel (di natura polisaccaridica), incapsulamento, adsorbimento su un supporto insolubile con formazione di legami ionici, polari, legami idrogeno.

37 PROCEDURE DI ANALISI CON SENSORI AMPEROMETRICI Analisi in batch Le analisi vengono effettuate ponendo il biosensore in unopportuna soluzione tampone posta in una cella, eventualmente termostata, sotto agitazione magnetica per consentire una diffusione costante ed omogenea del substrato verso il biosensore. Il sensore è collegato con un voltamperometro che applica una ddp ai due elettrodi e la misura di corrente viene registrata con un registratore. Quando la corrente di fondo raggiunge un valore stabile aliquote di campione o di soluzioni standard sono addizionate al tampone di misura dove interagiscono con il sistema biologico generando variazioni di corrente che sono correlate alla concentrazione di analita.

38 Schema di sistema in batch Elettrodo Becker Becker Ancoretta Agitatore magnetico AmperometroRegistratore

39 Sistema in flusso Il biosensore è inserito in una cella elettrochimica di flusso costituita da due o tre elettrodi. La cella elettrochimica è collegata ad una pompa peristaltica che trasporta tampone ad unopportuna velocità di flusso. La velocità di flusso influenza lintensità del segnale, il tempo di risposta ed il rumore di fondo dovuto a variazioni di pressione nella cella. Il flusso ottimale corrisponde a condizioni di compromesso tra questi parametri. Quando la corrente di fondo raggiunge un valore stabile soluzioni standard di analita o di campione preparate nello stesso tampone vengono trasferite alla cella generando variazioni di corrente.

40 Schema di sistema in flusso

41 Schema di sistema FIA In un sistema di analisi FIA (flow injection analysis) una valvola (Rheodyne) viene connessa in serie con un sistema a flusso. Quando la corrente iniziale raggiunge lo stato stazionario, si inietta attraverso la valvola la soluzione di standard o di campione e si registra la variazione di corrente.

42 FLOW INJECTION ANALYSIS (FIA) Tampone di lavoro Scarico Pompa Peristaltica Cella Elettrochimica Loop Valvola diniezione Registratore Amperometro


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