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Lezione III-IV martedì 9-11-2010 corso di genomica laurea magistrale Biotecnologia Industriale aula 6 orario : Martedì ore 14.00 - 16.00 Giovedì ore 13.00.

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1 Lezione III-IV martedì corso di genomica laurea magistrale Biotecnologia Industriale aula 6 orario : Martedì ore Giovedì ore D. Frezza

2 uso dellinformazione col sequenziamento cè stata lillusione di poter sapere veramente tutto dei genomi e dellinformazione genetica, ma è nata la genomica perchè si capiva che il problema era più complesso

3 polarismi scoperta con i sequenziamenti procarioti ed eucarioti : variazione e conservazione mettiamo insieme queste due evenienze formamlmente in opposizione. abbiamo visto che esiste una polarità una discrepanza logica che appare spesso in natura la polarità è compatibile senza dover eliminare una delle due? come possiamo rendere compatibile una contrapposizione così forte? la risposta la sapete già: è possibile i meccanismi che rendono possibile abbiamo detto che giocano sulla variabile tempo

4 gestire il polarismo salviamo il polarismo utilizzando questa contraddizione, possono coesistere entrambe: variabilità e conservazione il primo nei tempi lunghi, il secondo nel tempo breve Abbiamo già detto: era implicita in Mendel la conservazione era implicita in Darwin la variabilità delle specie una nellaltra quando è stata scoperta la mutagenesi si è aperta una nuova finestra per interpretare questi due fenomeni

5 la variabilità come mutazione In the 1920s, Hermann Muller discovered that x-rays caused mutations in fruit flies. He went on to use x-rays to create Drosophila mutants that he used in his studies of genetics. He also discovered that x-rays not only mutate genes in fruit flies but also have effects on the genetic makeup of humans.[1] The first mutagens to be identified were carcinogens, or cancer-causing substances. Early physicians detected tumors in patients more than 2,000 years before the discovery of chromosomes and DNA. In 500 B.C., the Greek Hippocrates named crab-shaped tumors cancer, meaning crab. 1 Campbell, Neil A. and Jane B. Reece. Biology. 7th ed. San Francisco, CA: Pearson Education, Inc, 2005.

6 scoperta legata ad un evento tragico chi scoprì il fenomeno legato alla variabilità genetica se ne accorse associando luso di sostanze tossiche belliche ad eventi di trasformazione genetica: le mutazioni prima Muller con Drosofila e raggi X, poi UV e poi la chimica: mostarda azotata, azoiprite ed altre in seguito, scoperte dalla Charlotte Auerbach

7 mutagenesi chimica The discovery of Mustard Gas by Charlotte Auerbach and Robson Science Mar 7;105(2723): The Chemical Production of Mutations. Auerbach C, Robson JM, Carr JG. Nature Mar 9;157:302. Chemical production of mutations. AUERBACH C, ROBSON JM. Perspectives on genetics: anecdotal, historical, and critical... - Google Books Result James Franklin Crow, William F. Dove Medical pages June 1993 The Discovery of Mustard Gas Mutagenesis by Auerbach and Robson in... had been obtained from experiments on chemical mutagenesis prior to books.google.it/books?isbn= X...

8 bilanciato il polarismo possono coesistere variabilità e conservazione studio dei genomi tramite sequenziamento completo slancio nella ricerca genomica e sviluppo di nuove tecniche nuove applicazioni di tecniche già note per sveltire i metodi

9 i genomi a disposizione procarioti compatti ma senza meiosi (aploidi) eucarioti con nuove strutture per la diploidia la complicazione a partire dagli eucarioti unicellulari lieviti, funghi, (Saccharomyces, Neurospora) strutture di base invariate già dai procarioti: RNA, ribosomi, tRNA, polimerasi membrane, le nuove evidenze:

10 la conoscenza negli eucarioti strutture paraloghe nelle nuove funzioni (omologie analogie) ma le nuove strutture ancora non si conoscono si parte dai geni, ma sono il 5% TUTTO IL RESTO é nuovo e questa è GENOMICA si sapeva che cera il DNA ripetuto: trasposoni, regioni GC rich, mini e microsatelliti e poi?

11 i meccanismi dellevoluzione elementare i processi evolutivi sono lontani da essere compresi nella complessità alcuni sono evidenti dalle analisi genomiche più semplici come abbiamo detto i confronti evolutivi ci aiutano i confronti ci parlano del rapporto tra funzione e strutture

12 i geni divergono e si duplicano Geni ortologhi e geni paraloghi Geni ortologhi: geni simili riscontrabili in organismi correlati tra loro. Il fenomeno della speciazione porta alla divergenza dei geni e quindi delle proteine che essi codificano. es. la -globina di uomo e di topo hanno iniziato a divergere circa 80 milioni di anni fa, quando avvenne la divisione che dette vita ai primati e ai roditori. I due geni sono da considerarsi ortologhi. Geni paraloghi: geni originati dalla duplicazione di un unico gene nello stesso organismo. es. -globina e -globina umana hanno iniziato a divergere in seguito alla duplicazione di un gene globinico ancestrale. I due geni sono da considerarsi paraloghi.

13 variabilità per divergenza Gene ancestrale duplicazione genica Gene A e B speciazione ortologhi paralog Gene A1 e A2 e B1 Specie 1 ortologhi Gene B2 Specie 2

14 alla scoperta del genoma: allontanandosi dai geni alla ricerca delle funzioni: analogia con il periodo precedente alla scoperta del codice genetico interpretazioni: studi attraverso i confronti su modelli i modelli sono validi perchè è esistita levoluzione conclusione: il genoma è dinamico a breve e lungo termine come ha fatto ad attrezzarsi per poter evolvere? (geni < del 5% del genoma)

15 come mai si usano organismi modello: ribadiamolo è possibile perchè ci sono: - i geni ortologhi (stessa origine nellancestrale e divergenza nelle specie successive), hanno la stessa funzione nelle specie diverse - i geni paraloghi derivano da duplicazioni e possono mantenere funzioni simili (DNA binding, kinasi ecc.) (levoluzione rimane la premessa inevitabile)

16 lunica spiegazione sembra autocelebrativa, tautologica il genoma non poteva esistere senza interazione (per definizione) se la vita è nata nel mondo ad RNA e poi è venuto il DNA ed ha cominciato ad interagire con proteine diventandone dipendente, ma anche il responsabile, linformazione genetica non poteva non essere dinamica. come sarebbe il genoma non interattivo?

17 da dove parte linterattività del genoma non cè funzione che non preveda interazione con altre strutture ed enzimi, linformazione passa attraverso interazioni - potrebbe risultare passivo quando deve essere replicato/duplicato; la struttura rende possibile ogni altra funzione che già conosciamo o che è ancora da individuare - sembra passivo ma non lo è nemmeno per la sintesi dellmRNA, manda segnali e ne riceve continuamente cambia strutturalmente : per il differenziamento: epigenetica meiosi: gameti: zigote: embrione: adulto

18 interazione del genoma nelle varie fasi sotto il nome della regolazione la struttura (anatomia) informazioni per le funzioni anche solo per la trascrizione la cromatina si altera la trasformazione inizia molto prima della trascrizione trascrizione = una delle funzioni finali

19 non cè soluzione di continuità linterazione non è saltuaria tutto il ciclo vitale di ogni organismo prevede interazione dinamica ad ogni passaggio il DNA-cromatina subisce trasformazione, alterazioni dallo zigote alle mitosi al differenziamento, ogni fase prevede quella successiva,il genoma riceve messaggi continuamente per sapere se fermarsi, procedere e cambiare funzioni

20 ovvio ma fondamentale linterazione genoma ambiente è continuo gli stimoli devono permettere la reattività ci deve essere esecuzione del programma ci deve essere flessibilità il programma può andare avanti se cè feedback positivo

21 bidirezionalità della trasformazione funzionale genoma (cromatina) ambiente: nucleo, citoplasma, extracellulare.....ecc. quando il genoma si attiva è perchè cè lambiente giusto per far partire determinate funzioni

22 come si inserisce la variabilità le differenze esistono, si sono accumulate, ad ogni meiosi si rimescolano ogni organismo che nasce ha un genoma ricombinante cosa comporta questa diversificazione

23 microvariabilità i polimorfismi : genetica quantitativa interattoma (non solo tra proteine) turn-over (rapidità-lentezza) effetti a cascata (attivazioni tramite trasformazioni post- traduzionali: fosforilazioni, metilazioni, glicosilazioni ecc.) modulazione dovuta ad effetti dei polimorfismi (osservati col confronto tra fenotipi/genotipi) trasduzione del segnale tipica dellinterazione intra-extra cellulare e citoplasmatica - nucleare dal nucleo al genoma e viceversa (ciclo continuo)

24 andata e ritorno linformazione arriva allinformatore e riparte (difficile separare i ruoli nel ciclo continuo) è un artificio porre un inizio e scegliere lo zigote come start-point, si potrebbero prendere i gameti o le gonadi o lindividuo adulto la trasduzione del segnale mette in comunicazione le varie parti della cellula e quindi dellorganismo ogni punto di un ciclo può essere scelto come inizio o fine adesso prendiamo il genoma come nostro riferimento come possiamo approcciare il genoma in maniera globale

25 la post genomica (di già?) dopo il sequenziamento dei genomi interi ancora una volta si scopre di non sapere è linizio del salto verso la genomica regolativa / o dello studio del genoma non tradotto è riduttivo credere che si conosca il genoma conoscendo solo la porzione codificante conseguenza: una parte del trascrittoma non è noto ignorando una bella parte delle funzioni del genoma post genomica non significa che la genomica sia superata, va capito che non basta conoscere le sequenze genomiche

26 approcci globali e olistici nuove metodologie trascrittoma proteoma - interattoma ma il restante 95%? 95% ? wide genome screening screening con tecniche diverse

27 studio nuovo cosa si può analizzare in che maniera genomica obbligatoriamente porta al confronto tra i vari possibili organismi modello o intraspecie centralità del modello umano oppure riferimento al modello umano (ricchezza di polimorfismi) ricerca di modelli per trovare semplificazioni e generalizzazioni

28 cosa si vuole vedere ? strutture e variabilità micro-arrays per ibridazione resequencing shot-gun parziali o globali SNPs e VNR ogni 500 bp del genoma

29 i vari approcci i diversi modelli permettono di produrre i nuovi approcci e le diverse tecniche dalle domande generali a quelle più specifiche o ai meccanismi sottostanti allargare linterattoma anche alla interazione col genoma pensare in maniera globale cercare di essere onnicomprensivi (presuntuoso ma necessario)

30 il problema globale rischio di genericità tutto o niente lo studio con le libraies è stato linizio i metodi globali: osservazioni col grandangolo necessità di non perdere anche i particolari guardare dal satellite ma con una risoluzione altissima

31 osservazione diretta e indiretta in quasi tutte le scienze si passa alla oservazione indiretta il DNA o le proteine non le vediamo, abbiamo prove indirette ci fidiamo delle osservazioni indirette ed il metodo passa attraverso luso dei controlli ossia della contraffabilità del risultato

32 convergenza delle osservazioni e riprove luso di organismi modello come riprova della universalità osservazioni riproposte anche su organismi di specie diverse difficoltà di riscontrare patologie in organismi molto diversi possibilità di osservare fenotipi simili in organismi anche molto diversi generalità di un fenomeno

33 troppi esempi a riprova delluniversalità dei promotori eucariotici e procariotici : tutti i costrutti inducibili o costitutivi transfettati cosa possiamo fare per capire il genoma nellera post-genomica mantenere la capacità di analisi nelle interazioni/variazioni nel contesto e fuori contesto in vitro veritas

34 fenotipi mutanti e polimorfismi dove si guarda cercando le funzioni genomiche creazione di esche per trovare con cosa interagiscono riprova in vivo con lorganismo transgenico per avere una conferma

35 approccio simmetrico da un fenotipo ricerca del fenomeno da riprodurre in vitro verificare se lo stesso costrutto interagisce con le stesse proteine tentativi non sempre di successo con two hybrid systems le tecniche hanno delle approssimazioni esca e oggetto interagente


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