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By NA 1 Diagnosi Prenatale II. By NA 2 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) Cromosomi di cui non è riconoscibile con le metodiche.

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1 By NA 1 Diagnosi Prenatale II

2 By NA 2 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) Cromosomi di cui non è riconoscibile con le metodiche classiche la provenienza Frequenza alla nascita /1000 Difficile correlazione genotipo-fenotipo in diagnosi prenatale Importante il rilievo della caratterizzazione molecolare

3 By NA 3 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) In più del 50% dei casi è oggi possibile fare previsioni fenotipiche corrette: Invdup15 (50% ESAC) Cromosomi sessuali

4 By NA 4 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) Amniocentesi paziente di 41 aa Presenza di un ESAC in tutti i cloni de novo piccole dimensioni

5 By NA 5

6 6

7 7 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) CBG positivo DA/DAPI positivo FISH centromero 15 positiva Invdup(15) Definizione del tipo

8 By NA 8

9 9

10 10 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) FISH sonde pericentromeriche (D15S11; GABR3) NEGATIVA Invdup(15) tipo I Assenza di anomalie del fenotipo

11 By NA 11 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) Rischio di Disomia Uniparentale 15q11-q13 da origine postzigotica del marcatore Materna Paterna s. Prader/Willi s. Angelman

12 By NA 12

13 By NA 13

14 By NA 14 D15S130D15S165 P F M Polimorfismi Cromosoma 15 - Tecnica PAGE

15 By NA 15 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) ESCLUSIONE DISOMIA UNIPARENTALE CON MARCATORI POLIMORFICI DEL CROMOSOMA 15

16 By NA 16

17 By NA 17

18 By NA 18

19 By NA 19

20 By NA 20 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) Amniocentesi paziente di 35 aa Presenza di un ESAC de novo piccole dimensioni

21 By NA 21 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) CBG positivo DA/DAPI negativo FISH 13,14,15,21,22,X,Y negativa Rischio alterazioni fenotipiche 5% Ecografia/Ecocardiografia Riduzione rischio di 1/3

22 By NA 22 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) Paziente in gravidanza di 31 aa Riscontro ecografico NT aumentata

23 By NA 23 Toshiba Instruments

24 By NA 24 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) NT aumentata rischio aneuploidie Prelievo villi coriali a 11 settimane Presenza di ESAC de novo piccole dimensioni, bisatellitato

25 By NA 25 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) FISH 13,14,15,21,22 Positiva per centromero 22 invdup(22) Cat/Eye syndrome

26 By NA 26 Cat Eye syndrome Malf. orecchio86% Malf.anorettali 81% Malf. urogenitali71% Coloboma occhio61% Altre Malformazioni

27 By NA 27 Cat Eye syndrome Malformazioni cardiache62% di cui 1/3 Anomalie del Ritorno Venoso Polmonare

28 By NA 28 Cat Eye syndrome RITARDO MENTALE ?? Severo7% Moderato/lieve47%

29 By NA 29 Cat Eye syndrome Assenza di correlazioni tra estensione/regioni geniche presenti nel cromosoma invdup(22) ed anomalie del fenotipo

30 By NA 30 Cat Eye syndrome CES Tipo I vs CES Tipo II non ha utilità dal punto di vista clinico

31 By NA 31

32 By NA 32

33 By NA 33

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35 By NA 35

36 By NA 36

37 By NA 37 Mosaicismo Amniocentesi cellule dall epiblasto della massa cellulare interna. Villocentesi – Coltura a breve termine cellule del trofoblasto. Villocentesi – Coltura a lungo termine cellule dello stroma (mesoderma extraembrionario).

38 By NA 38

39 By NA 39 MOSAICISMO I Livello: singola cellula II Livello: due o più cellule in una flask con la stessa anomalia o singolo clone III Livello: due o più cellule in più flask con la stessa anomalia o almeno 2 cloni

40 By NA 40 Liquido Amniotico Mosaicismi Livello I % Livello II % Livello III < 0.2 %

41 By NA 41 MOSAICISMO PSEUDOMOSAICISMO MOSAICISMO CONFINATO ALLA PLACENTA (chorion, amnion) MOSAICISMO VERO La grande maggioranza dei mosaicismi in diagnosi prenatale non si correla ad anomalie fenotipiche fetali

42 By NA 42 Mosaicismo trisomia 11 Paziente di 29 anni Indicazione: familiarità s. Down Cariotipo fetale 46,XX (10 cloni)/47,XX,+11 (1 clone) Mosaicismo II livello

43 By NA 43 Linee Guida work-up Moderato: altre 10 cellule dalla flask con anomalia oppure altri 12 cloni. Flask Cr. Sessuale sovra-numerario (SC,MC) Trisomia 1,2,3,4,5,6,7, 10,11,16,17,19 (SC, MC) 45,X - Monosomie (MC) Alt. bilanciate (MC) Marcatore (SC) In situ Cr. Sessuale sovra-numerario (SCo,MCo) Trisomia 1,2,3,4,5,6,7, 10,11,16,17,19 (SCo, MCo) 45,X - Monosomie (SCo, MCo) Alt. bilanciate (MCo) Marcatore (SCo)

44 By NA 44 Mosaicismo trisomia 11 Estensione analisi a 41 cloni Cariotipo 46,XY (39 cloni)/47,XY,+11 (2 cloni) Mosaicismo III livello

45 By NA 45 Liquido Amniotico Mosaicismi - Livello III Conferma sino al 40 % alla cordocentesi ed al 50%(autosomi), 80% (ESAC) e 90% (cr. sessuali) al follow-up Tipo di Cromosoma (es. ESAC) Utilizzo e limiti della Cordocentesi

46 By NA 46 Mosaicismo trisomia 11 Solo 2 casi in letteratura, con bassa frequenza (2.7 e 5.5%), apparentemente non associati ad alterazioni fenotipiche Rischio s. Beckwith-Wiedemann da disomia uniparentale 11

47 By NA 47 Meccanismi UDP Complementazione gametica Recupero dello zigote trisomico Duplicazione mitotica Errore post-zigotico

48 By NA 48

49 By NA 49 DISOMIA UNIPARENTALE CROMOSOMA 11 Regione 11p15.5 eterodisomia paterna Alterata espressione di geni da imprinting genomico 2 casi di s. Beckwith-Wiedemann

50 By NA 50 DISOMIA UNIPARENTALE CROMOSOMA 11 Polimorfismi Cromosoma 11 - Tecnica PAGE P F M P F M P F M

51 By NA 51 Mosaicismo trisomia 11 Esame citogenetico: Cariotipo 46,XY (150 metafasi) Attesa Fenotipo nella norma (follow-up a 24 mesi) Screening molecolare con microsatelliti cromosoma 11: Esclusione UDP

52 By NA 52 Mosaicismo trisomia 4 Paziente di 40 anni Indicazione: età Cariotipo fetale 46,XX (31 cloni)/47,XX,+4 (9 cloni) Mosaicismo III livello

53 By NA 53 Mosaicismo trisomia 4 Solo 3 casi in letteratura: -2 con bassa frequenza ( 10%), apparentemente non associati ad alterazioni fenotipiche -1 con an. faciali e malf. multiple: ad 1 anno buon follow-up -Problema UPD

54 By NA 54 Mosaicismo trisomia 4 Counselling Ecografia/Ecocardiografia fetale Prelievo sangue funicolare per esame cariotipo ed esclusione UPD In caso di interruzione: Esame citogenetico su tessuti diversi

55 By NA 55 Mosaicismo trisomia 4 Ipoplasia cerebellare Ventricolomegalia borderline Fetal MRI

56 By NA 56 Mosaicismo trisomia 4 CAV completo

57 By NA 57 Mosaicismo trisomia 4 Micrognazia Ipotelorismo Deformità rachide (emivertebre) s. atresia esofagea

58 By NA 58 Mosaicismo trisomia 4 DISOMIA UNIPARENTALE Polimorfismi Cromosoma 4 - Tecnica PAGE D4S243D4S175 P CF M P CF M

59 By NA 59 Diagnosi Malattie DNA Numero elevato malattie Numero elevato di mutazioni (es. Fibrosi cistica) Coinvolgimento geni diversi (es. Retinite pigmentosa)

60 By NA 60 Diagnosi Malattie DNA - Prerequisiti Conoscenza gene/i Identificazione della specifica mutazione

61 By NA 61 Conoscenza geni Mendeliane Talassemia Fibrosi cistica Chorea di Huntington Distrofia di Duchenne Complesse (loci suscettibilità) ApoE Alzheimer 19p13;Xq24 Cefalea 12q;2q Diabete NID 3q21 Psoriasi

62 By NA 62 Conoscenza geni 8000 malattie geni noti 30% (60-70% pazienti)

63 By NA 63 Diagnosi Malattie DNA - Prerequisiti Conoscenza gene/i implicati Identificazione della specifica mutazione

64 By NA 64 Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD) Una delle più comuni malattie genetiche dell infanzia Ubiquitariamente diffusa nel mondo Colpiti pressochè esclusivamente maschi Ereditata come malattia recessiva X-linked Si manifesta con debolezza muscolare progressiva. I muscoli mostrano una pseudo-ipertrofia, molto evidente nel polpacci: in realtà le fibre muscolari sono rimpiazzate da tessuto grasso/adiposo.

65 By NA 65 DIAGNOSI DMD Progressiva perdita muscolare e debolezza. Ridotta contrazione muscolare. Incurvamento della colonna vertebrale. Posizionamento doloroso delle articolazioni. Difficoltà nei movimenti quotidiani. livelli CK Biopsia muscolare

66 By NA 66 DIAGNOSI DMD ANALISI DI DELEZIONE (60% circa dei casi): – PCR multipla per 26 esoni dei 79 presenti nel gene. – Evidenziazione degli amplificati su gel-elettroforesi – Si diagnostica la delezione quando un prodotto di amplificazione è assente in due separate reazioni di amplificazione. ANALISI COMPLETA DEL GENE: – Se non è presente una delezione ampia, allora si ricorre ad uno studio dettagliato del gene mediante tecniche analitiche, sino al sequenziamento diretto. – Una volta trovata la mutazione nel probando, è possibile testare rapidamente qualsiasi soggetto della famiglia a rischio.

67 By NA 67 MULTIPLEX P.C.R.

68 By NA 68 DIAGNOSI DMD Paziente di 27 anni in gravidanza con fratello affetto da DMD Analisi Fratello Delezione degli esoni Studio familiare di linkage (Analisi Aplotipo con marcatori intragenici) Paziente Portatrice della Mutazione

69 By NA 69 DIAGNOSI DMD Paziente 27 anni portatrice in gravidanza Prelievo dei Villi coriali a 10 settimane 90% dei villi 10% dei villi ESTRAZIONE DNA (se possibile) Analisi molecolare Analisi cariotipo con PCR multipla

70 By NA 70 DIAGNOSI DMD Paziente di 23 anni in gravidanza con due nipoti deceduti per DMD Studio familiare di linkage (Analisi Aplotipo con marcatori intragenici)

71 By NA 71 DIAGNOSI DMD

72 By NA 72 DIAGNOSI DMD Paziente non Portatrice dell Aplotipo associato alla DMD DIAGNOSI PRENATALE NON NECESSARIA !!!

73 By NA 73 DIAGNOSI DMD Paziente di 26 anni in gravidanza (13 settimane) con due figli affetti da DMD Analisi Figli No Delezione degli esoni Studio di linkage

74 By NA 74 DIAGNOSI DMD Aplotipo fetale ricombinante Rischio DMD per il feto: 14% (62/79 esoni derivano dal materno normale)

75 By NA 75 Fibrosi cistica 1000 variazioni di sequenza - 83% (>800) mutazioni - 17% polimorfismi Caucasici 70% F508

76 By NA Mutazioni più frequenti D.R. = 80%

77 By NA 77 Caratterizzazione clinica complessa Ragazza 17 anni Alla età di 12 anni: Iridi stellate Ritardo mentale s. Williams Personalità cocktail party

78 By NA 78 SINDROME DI WILLIAMS Dismorfismo faciale (elfin facies) Ritardo di crescita pre e postnatale Deficit cognitivi (alt. integrazione spazio-visiva); lieve RM Stenosi aortica sopravalvolare, s. polmonare, difetti di setto, prolasso mitrale Ipercalcemia infantile DELEZIONE 7q11.23 gene ELN


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