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L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo.

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1 L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo di: Chimica analitica strumentale (4 CFU) Giorgio Bonaga CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC) (CAS-4b) Giorgio Bonaga

2 6. TECNICHE DI SEPARAZIONE Le fasi stazionarie in HPLC sono costituite da particelle di silice (più raramente allumina) che funzionano da ADSORBENTI (cromatografia di adsorbimento = LSC) o da SUPPORTO (cromatografia di partizione = LLC). La diffusione della silice è giustificata da alcune sue proprietà specifiche: è in grado di sopportare pressioni molto elevate (> 1000 atm); è chimicamente stabile verso tutti i solventi a pH non superiore a 8; è facilmente funzionalizzabile (derivatizzabile); è facile ottenerla sottoforma di particelle uniformi; è disponibile in varie dimensioni e porosità ( Å). Nella Bonded Phase Chromatography (BPC), che è una cromatografia di partizione, le particelle di supporto sono legate a dei composti organici. Nella Size Exclusion Chromatography (SEC) le particelle di supporto hanno una porosità controllata e separano i soluti in funzione della loro dimensione molecolare (che è cosa diversa dal loro peso molecolare). Nella Ion Exchange Chromatography (IEC) i gruppi ionici (cationici od anionici) sono legati chimicamente alla superficie del supporto. Giorgio Bonaga

3 acido arachidonico C 24 H 42 O 2 mol wt 362 N,N,N-triottilammina C 24 H 51 N mol wt 353 PORO DIMENSIONE MOLECOLARE (STRUTTURA) E PESO MOLECOLARE

4 La complessità della correlazione soluto/fase stazionaria/fase mobile rende conto del perché, in generale, in tutte le tecniche di separazione LC si utilizza una grandissima varietà di solventi; la polarità della fase mobile, anche se non è lunico, è il più importante fattore che produce una migliore solvatazione del soluto e dunque una più veloce eluizione. Questa necessità di variare la composizione della fase mobile per ottimizzare le separazioni dei soluti è alla base della classificazione delle tipologie di eluizione della LC: a. ELUIZIONE ISOCRATICA La composizione della fase mobile rimane costante per tutto il tempo delleluizione. b. ELUIZIONE A GRADIENTE La composizione della fase mobile viene fatta variare durante leluizione (con aumento della percentuale del solvente più polare), allo scopo di separare tutti i soluti, anche quelli che hanno fattori di capacità (k) molto diversi. Giorgio Bonaga

5 A) CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO (Liquid Solid Chromatography) FASE MOBILE: liquido FASE STAZIONARIA: solido adsorbente La separazione si basa sullassorbimento dei soluti sulla superficie della fase stazionaria, dotata di siti attivi che danno luogo a interazioni non specifiche (forze di dispersione di Van der Waals) e specifiche (legami idrogeno, interazioni dipolo-dipolo). Le fasi stazionarie adsorbenti più utilizzate nella LSC sono la silice (SIO 2 ) e lallumina (Al 2 O 3 ), anche se la silice è preferita per la sua maggiore capacità di carica, ma anche perché è attiva sia con i gruppi silanolici liberi ( fase diretta ) che con i gruppi silanolici funzionalizzati ( fase inversa ). I siti attivi della fase stazionaria sono sempre ricoperti da molecole del solvente ( solvatazione della fase stazionaria ), così come il solvente circonda le molecole di soluto ( solvatazione del soluto ). Il soluto proveniente dalla fase mobile sposta, per competizione, dalla superficie della fase stazionaria un certo numero di molecole di solvente. Giorgio Bonaga

6 particella di fase stazionaria assorbente (frammento) soluto solvente H H H H H H O O O O O O LSC IN FASE DIRETTA MmMm MmMm MmMm Giorgio Bonaga Sm MmMm MaMa MaMa SaSa SmSm SaSa

7 Ponendo: S m = soluto nella fase mobile(= 3) M a = solvente adsorbito sulla fase stazionaria(= 6) S a = soluto adsorbito sulla fase stazionaria(= 2) M m = solvente che passa nella fase mobile(= 4) Lequilibrio : S m + M a S a + M m è espresso da: K ads = Nellesempio dellanimazione: K ads = = 0,44 [S a ]. [M m ] [S m ]. [M a ] Giorgio Bonaga [2]. [4] [3]. [6]

8 a. FASE STAZIONARIA Nella cromatografia di adsorbimento la fase stazionaria solida più utilizzata è la silice, con due modalità di impiego: 1.silice tal quale (fase diretta) con i gruppi silanolici liberi: a) i soluti polari sono molto adsorbiti e per eluire con t R ragionevoli richiedono una fase mobile di polarità intermedia; b) i soluti non polari non sono adsorbitii ed eluiscono con t R confrontabili con quelli dei solventi ( tailing ); 1.silice funzionalizzata (fase inversa) con gruppi silanolici derivatizzati: a) i soluti non polari sono molto adsorbiti e per eluire con tR ragionevoli richiedono una fase mobile a bassa polarità; b) i soluti polari non sono adsorbiti ed eluiscono con tR confrontabili con quelli dei solventi. Giorgio Bonaga soluto non polare solvente FASE DIRETTA

9 Le particelle di silice sono di due tipi: particelle irregolari a corpo poroso, con diametro compreso tra 5-60 m; particelle regolari con strato poroso di 1-2 m (pellicolare), con diametro compreso tra m; m irregolare a corpo poroso 40 m regolare pellicolare (2 m) 5-10 m irregolare a corpo poroso 10 m regolare pellicolare (1 m) Giorgio Bonaga

10 gruppo silossanico gruppo silanolico (pK a 9) gruppi silanolici geminali Nella GSC in fase diretta, la silice va attivata per aumentare il numero di gruppi silanolici, normalmente presenti in quantità limitata rispetto i gruppi silossanici. Lattivazione si fa trattando con una soluzione 1M di HCl allebollizione per ore. I gruppi silosssanici presenti nello strato pellicolare esterno nelle particelle di grandi dimensioni e allinterno dei canalicoli delle particelle di piccole dimensioni si idrolizzano parzialmente in gruppi silanolici. Per eliminare lacqua di idrolisi, che si lega con legami idrogeno ai gruppi silanolici, si essica in stufa non oltre i 200°C per evitare che i gruppi silanolici si ricondensino in gruppi silossanici. Giorgio Bonaga

11 I soluti vengono adsorbiti sui siti attivi della fase stazionaria in funzione della loro polarità ed è il gruppo funzionale più polare che determina il tempo di eluizione (di ritenzione) di un soluto. Un altro elemento strutturale importante è il numero e la posizione dei gruppi funzionali, perché influenza il numero di interazioni soluto/fase stazionaria. H O Si O O O O H O H O H O H O H O catecolo H O O H idrochinone COMPETIZIONE Giorgio Bonaga

12 ESEMPIO Qualè lordine di eluizione dei 3 isomeri di posizione della nitroanilina in una LSC ? Le strutture dei tre isomeri mostrano che l o -nitroanilina (1) forma legami idrogeno intramolecolari che, impegnando i gruppi funzionali, riduce linterazione con la fase stazionaria. La m -nitroanilina (2), per motivi di geometria strutturale può interagire con uno soltanto dei suoi gruppi funzionali, mentre la p -nitroanilina (3) può interagire con entrambi. La risposta, in ordine di tempo di ritenzione crescente, è: o m p + o t (sec) p m o < m < p Giorgio Bonaga

13 tRtR TEMPI DI RITENZIONE RELATIVI (silice e allumina) idrocarburi paraffinici C n H 2n+2 idrocarburi olefinici C n H 2n idrocarburi aromaticiC 6 H 5 -R alogenuriRX tioeteri (solfuri)R2SR2S eteriROR nitroderivati RNO 2 esteri chetoni aldeidiRCOOR, R 2 CO, RCHO ammine primarie ammine secondarieRNH 2, R 2 NH alcoliROH ammidi RCONH 2 acidi carbossiliciRCOOH (acqua)

14 b. FASE MOBILE La forza del solvente della fase mobile è espressa dal calore che si sviluppa quando quel solvente puro interagisce con la fase stazionaria. Questo parametro è detto forza delleluente ( °) ed esprime lenergia di adsorbimento del solvente per area unitaria di superficie adsorbente standard. Tanto maggiore è linterazione tra il solvente e la fase stazionaria tanto maggiore è lenergia che si sviluppa, tanto più elevata è la polarità del sovente e tanto più alta è la sua forza eluente. Lelenco dei valori di ° si chiama serie eluotropica per una certa fase stazionaria. Un aumento di ° di 0,05 unità produce una diminuzione di tutti i valori di k di un fattore compreso tra 3 e 4. La corretta combinazione tra solventi a differente ° determinerà tempi di ritenzione adeguati alla separazione dei soluti. Sfortunatamente ° non varia linearmente con i rapporti volumetrici e pertanto la scelta della combinazione ottimale dei solventi della fase mobile è un po più complessa (sono disponibili diagrammi di correlazione tra ° e la combinazione di un certo numero di fasi mobili binarie di comune impiego). Nel caso di overlapping di picchi, se si sostituisce un solvente con un altro, in modo da mantenere più o meno costante il fattore di capacità k, si ottiene una variazione del fattore di selettività che consente la risoluzione dei picchi sovrapposti. Giorgio Bonaga

15 SOLVENTE ° ° pentano0,00dicloroetilene0,49 etere di petrolio0,01butanone0,51 esano0,01diossano0,56 cicloesano0,04acetone0,56 tetraclorometano0,18acetato di etile0,58 xilene0,26dimetilsolfossido0,62 toluene0,29acetonitrile0,65 clorobenzene0,30piridina0,71 benzene0,32 iso -propanolo0,82 etere etilico0,38 n -propanolo0,82 cloroformio0,40metanolo0,95 diclorometano0,42acido acetico1,00 tetraidrofurano0,45acqua elevata SERIE ELUOTROPICA PER ALLUMINA ( * ) (*)(*) per la silice i valori della forza eluente ( °) riferiti allallumina vanno moltiplicati per 0,8. Giorgio Bonaga

16 a. ELUIZIONE ISOCRATICA La composizione della fase mobile rimane costante per tutto il tempo delleluizione. b. ELUIZIONE A GRADIENTE La composizione della fase mobile varia durante leluizione (con aumento della percentuale del solvente più polare), allo scopo di separare tutti i soluti, anche quelli che hanno fattori di capacità (k) molto simili. 1. con fase mobile debole i soluti che interagiscono debolmente con la fase stazionaria vengono separati ed eluiscono con tempi di ritenzione normali, ma quelli che interagiscono fortemente eluiscono con tempi di ritenzione eccessivi (con notevole allargamento dei picchi); 2. con fase mobile forte i soluti che interagiscono debolmente eluiscono rapidamente con tempi di ritenzione troppo ridotti (nel tailing del solvente), mentre quelli che interagiscono fortemente vengono separati ed eluiscono con tempi di ritenzione normali. 3. con fase mobile a gradiente di polarità si ottiene leluizione con i tempi di ritenzione ottimali per tutti i soluti. Giorgio Bonaga

17 GRADIENTE DI SOLVENTE SOLVENTE INTERMEDIO SOLVENTE FORTE SOLVENTE DEBOLE EFFETTI DELLA FORZA DEL SOLVENTE SULLA SEPARAZIONE Giorgio Bonaga

18 La LSC è una tecnica adatta per separare: soluti con mol. wt < 5000 soluti solubili in solventi non polari soluti omologhi soluti isomeri Attualmente la LSC viene molto utilizzata nei processi di estrazione (SPE = Solid Phase Extraction ) di microcomponenti da matrici complesse di mezzi acquosi, anche grazie alla vasta gamma di adsorbenti solidi a base di silice funzionalizzata (fase inversa, fase diretta, scambio ionico), piuttosto che nei processi di separazione. Giorgio Bonaga H RRR H H R H cistrans

19 t (min) COLONNA: 1000 mm x 3,0 mm i.d. FASE STAZIONARIA: silice pellicolare 10 m ELUIZIONE ISOCRATICA: CH 2 Cl 2 / iso -C 8 H 18 =50/50 DETECTOR: UV 254 m trans -3,4 difenil-3-acetil-pirazolina 2 cis -3,4 difenil-3-acetil-pirazolina SEPARAZIONE DI ISOMERI GEOMETRICI N N COOCH 3 N N COOCH 3 Giorgio Bonaga

20 SEPARAZIONE DI XANTINE ESTRATTE DA SIERO DI SANGUE 1 t (min) COLONNA: 50 mm x 4,6 mm i.d. FASE STAZIONARIA: silice 5 m ELUIZIONE ISOCRATICA: CHCl 3 /C 7 H 16 /C 2 H 5 OH/CH 3 COOH=56,3/37,6/6,0/0,1 DETECTOR: UV 254 m 1 2 caffeina teofillina 3 4 teobromina N-idrossietil-teofillina N N N N O O H 3 C CH 3 CH 3 N N N N O O H 3 C H CH 3 N N N N O O H CH 3 CH 3 N N N N O O H 3 C CH 2 CH 2 OH C H 3 Giorgio Bonaga

21 B) CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE (Liquid Liquid Chromatography) FASE MOBILE: liquido FASE STAZIONARIA: liquido (su supporto solido inerte o a fase legata) La separazione si basa sulla ripartizione del soluto tra la fase mobile liquida e la fase stazionaria (liquido su supporto solido inerte o film di gruppi organici legati chimicamente al supporto solido inerte). Questa distinzione comporta una prima classificazione della LC di partizione: a fase legata (BPC = Bonded Phase Chromatography ) a fase non legata (LLC = Liquid Liquid Chromatography ) Giorgio Bonaga

22 CROMATOGRAFIA A FASE LEGATA (BPC) Ha quasi completamente sostituito la più tradizionale cromatografia liquido- liquido (con la quale si ha perdita di fase stazionaria ed è difficile operare con eluizioni a gradiente). I gruppi organici che si fissano chimicamente sulla superficie del supporto possiedono una certa mobilità conformazionale che conferisce loro un comportamento simile a quello di un liquido (stato pseudo-liquido). La BPC può essere: FASE MOBILE: polare (H 2 O, CH 3 OH, CH 3 CN) 1. IN FASE INVERSA FASE STAZIONARIA: non polare ( Si-O-SiR 3 ) SOLUTI: non polari FASE MOBILE: non polare (nC 6 H 14, Et 2 O, CHCl 3 ) 2. IN FASE DIRETTA FASE STAZIONARIA: polare ( Si-OH) SOLUTI: polari Giorgio Bonaga

23 fase mobile (polare) fase stazionaria (non polare) CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA Reverse Phase Chromatography (RPC) Si Giorgio Bonaga Si

24 fase mobile (non polare) CROMATOGRAFIA IN FASE DIRETTA Normal Phase Chromatography (NPC) fase stazionaria (polare) Giorgio Bonaga Si

25 AB C ABC A B C AB C CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA CROMATOGRAFIA IN FASE DIRETTA POLARITA DEI SOLUTI: A >B > C FASE MOBILE: elevata polarità FASE MOBILE: bassa polarità FASE MOBILE: media polarità Giorgio Bonaga

26 1. CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA (Reverse Phase Chromatography) a. FASE STAZIONARIA Si utilizzano materiali diversi: silice allumina carbone pirolitico polimeri (polietilene) e copolimeri (stirene/divinilbenzene) La silice è il materiale più utilizzato perché la tecnologia attuale consente di ottenere particelle di dimensioni e porosità controllate, oppure particelle con uno strato pellicolare poroso. Inoltre è il materiale che può essere più facilmente funzionalizzato. silice allumina carbone pirolitico resine Giorgio Bonaga

27 FUNZIONALIZZAZIONE DELLA SILICE Il trattamento con HCl a riflusso produce lidrolisi dei gruppi silossanici superficiali con formazione di gruppi silanolici, mentre con il riscaldamento a 200°C si elimina lacqua di idrolisi senza produrre la ricondensazione dei gruppi silanolici in gruppi silossanici. La superficie porosa del supporto consente una migliore adesione della fase legata. Ai gruppi silanolici così ottenuti si possono legare composti organici diversi, con quattro meccanismi di reazione differenti (funzionalizzazione). silice al microscopio elettronico gruppo silanolico poro gruppo silossanico Giorgio Bonaga

28 + + HCl + SO 2 1. Esterificazione ( fase etere ) La silice viene riscaldata a riflusso in sospensione con alcoli alifatici (decanolo) anche se, essendo una reazione di equilibrio, si forma solo parzialmente il decanossi-silicato (peraltro instabile). 2. Dialchilamminazione ( fase dialchilammina ) La silice viene riscaldata a riflusso in sospensione con cloruro di tionile e il cloro- silicato che si forma viene fatto reagire con unammina secondaria. Il dialchilammino- silicato che si forma è più stabile de decanossi-silicato, ma in ambiente acido si ha la protonazione dellammina con scissione del legame Si-N HCl Giorgio Bonaga

29 3. Alchilazione ( fase idrocarburica ) Il cloro-silicato ottenuto in condizioni anidre viene fatto reagire in condizioni anidre con reattivo di Grignard ; seppure con una resa bassa si forma un alchil-silicato. 4. Silanizzazione ( fase silossanica ) La silice, in sospensione con un solvente non polare anidro (esano o toluene), viene fatta reagire a riflusso con un agente silanizzante, mantenendo la miscela in ebollizione. Lagente silanizzante, in realtà, può essere un trialchilclorosilano (R 3 SiCl), un dialchildiclorosilano (R 2 SiCl 2 ) o un alchiltriclorosilano (RSiCl 3 ). Il primo agente silanizzante produce una funzionalizzazione a fase monomerica (i sostituenti alchilici sono sullo stesso atomo di silicio), con una resa del 50% circa. Il secondo e terzo agente silanizzante producono una funzionalizzazione a fase polimerica (i sostituenti alchilici sono su atomi di silicio vicinali), con un resa rispettivamente del 100% e del 50% circa. La funzionalizzazione a fase monomerica conferisce una maggior mobilità conformazionale alla catena idrocarburica e dunque un più spiccato carattere [pseudo]liquido alla fase legata. + + HCl + R-Mg-Br + Cl-Mg-Br

30 TRIALCHILCLOROSILANO ( fase monomerica ) Giorgio Bonaga R Cl Si R R R Cl Si R R R Cl Si R R R R R R R R

31 DIALCHILDICLOROSILANO ( fase polimerica ) Giorgio Bonaga R Cl Si R Cl R Si R Cl R Si R R R

32 ALCHILTRICLOROSILANO ( fase polimerica ) Giorgio Bonaga R Cl Si Cl R Si Cl R Si Cl R Si Cl OH idrolisi

33 La funzionalizzazione della superficie di silice conferisce proprietà caratteristiche alla fase stazionaria, ma la grande polarità dei gruppi silanolici residui (da 8 moli/m 2 la silanizzazione li riduce a 4 moli/m 2, con una resa di circa il 50%) può perturbare queste proprietà acquisite. È il motivo per cui si opera una definitiva silanizzazione ( end-capping o capping off ) con trimetilclorosilano (TMS), che funzionalizza tutti i gruppi silanolici residui con un agente a fase monomerica. Esempio La prima silanizzazione con ottadecildimetilclorosilano e l end-capping con trimetilclorosilano producono una silice funzionalizzata: 50% da silanizzazione 50% da end capping I materiali alternativi alla silice (carbone attivo, polietilene, copolimeri stirene/divinilbenzene) sono non polari e dunque non consentono le reazioni di funzionalizzazione.

34 I gruppi legati alla silice che più frequentemente vengono utilizzati sono: ottadecil - ottil - etil - fenil - cianoetil - idrossietil - amminoetil - A FASE DIRETTA POLARITA

35 La conformazione delle catene dei gruppi legati può essere a palizzata, a pelliccia ed irregolare. La più efficiente è quella a pelliccia, ma in realtà la disposizione dipende dalla fase mobile impiegata. Ad esempio, con C18 e fase mobile non polare si ottiene quella a pelliccia, mentre con fase mobile polare si ottiene quella a palizzata. Ovviamente con fase mobile fatta di solventi non polari/polari si passa da una conformazione allaltra. a palizzataa pellicciairregolare

36 La fase stazionaria a base di silice nella cromatografia di ripartizione deve essere meno polare dei soluti, ma se la fase è legata devessere simile ai soluti. La ripartizione è un fenomeno complesso di competizioni tra le interazioni soluto/fase stazionaria e soluto/fase mobile, il cui bilancio finale (unitamente alla temperatura e alla pressione di esercizio) determinano i tempi di ritenzione dei soluti e, in definitiva, la possibilità di separare i componenti di una miscela. SOLUTIFASE STAZIONARIA composti aromaticisilice fenilica dioli e zuccheri silice cianoetilica silice amminoetilica alcoli a basso peso molecolare silice-C8 silice-C2 acidi grassisilice-C18

37 INTERAZIONI SOLUTO/SOLVENTE I tre soggetti attivi nel processo di separazione sono il soluto, la fase mobile e la fase stazionaria. Le interazioni tra soluto/solvente sono preliminari alla comprensione dei principi che governano la scelta della composizione ottimale della fase mobile per separare i componenti di una miscela. 1.interazioni dipolo istantaneo/dipolo istantaneo: dovute allinduzione tra solventi non polari (es.: cloroformio) e soluti non polari (es.: decano). 2. interazioni dipolo permanente/dipolo permanente: dovute allinduzione tra solventi polari (es.: acetonitrile) e soluti polari (es.: aldeide). CHCl CH 3 -(CH 2 ) 8 -CH CH 3 -C N C HO R = Giorgio Bonaga

38 3. legami idrogeno: dovuti allinterazione tra un solvente (es.: acqua) contenente un atomo di idrogeno legato a un atomo ad elevata elettronegatività (N, O, F) e un soluto (es.: ammina secondaria) contenente un atomo ad elevata elettronegatività (N, O, F) con una coppia di elettroni di non legame. 4. interazioni dielettriche: dovute allinterazione tra solventi ad elevata costante dielettrica ( ) e soluti elettricamente carichi (ioni positivi e negativi). O H N H R H R Giorgio Bonaga

39 b. FASE MOBILE Nella LC di ripartizione è il fattore di capacità k quello più facile da modificare perché k dipende essenzialmente dalla composizione della fase mobile. Il range ideale del k è compreso tra 2 e 10, ma per miscele molto complesse lintervallo può estendersi da 0,5 a 20. Solo dopo aver ottimizzato il k si può agire sul fattore di selettività (a questo punto modificando la sola fase stazionaria) e, infine, sul fattore di efficienza N (utilizzando una colonna di lunghezza maggiore o di diametro interno minore). Nella cromatografia liquida di ripartizione oggi più utilizzata, la RPC (fase stazionaria non polare, fase mobile polare, soluti non polari) lequilibrio che determina la ritenzione dei soluti è basato sulla teoria solvofobica, secondo la quale i soluti idrofobici si ripartiscono tra la fase stazionaria e la fase mobile non per effetto delle interazioni attrattive con la fase stazionaria, ma per le interazioni repulsive con la fase mobile. Più precisamente, i soluti poco polari che hanno una repulsione verso la fase mobile occupano lo spazio minimo disponibile nella fase mobile e conseguentemente tenderanno a trasferirsi nella fase stazionaria. Meno polare è il soluto e più polare è la fase mobile tanto maggiore è il trasferimento del soluto nella fase stazionaria e tanto maggiore sarà il suo tempo di ritenzione. Giorgio Bonaga

40 fase mobile polare RPC: TEORIA SOLVOFOBICA fase stazionaria non polare soluto poco polare (IDROFOBICO) repulsione soluto/fase mobile I solventi della fase mobile che interagiscono in modo rilevante con i soluti sono detti forti (in termini di maggiore polarità). Nella cromatografia di partizione la forza del sovente (che è definita forza delleluente o °) nella SLC - è detta indice di polarità (P). Snyder definisce questo indice come: la solubilità di una sostanza in tre solventi: diossano (accettore di protoni con basso momento dipolare), nitrometano (accettore di protoni con elevato momento dipolare) e alcol etilico (donatore di protoni con elevato momento dipolare)

41 Giorgio Bonaga = 0,45 D = 1,69 D = 3,50 D La fase mobile deve, idealmente, possedere 3 requisiti: 1. bassa viscosità, per evitare pressioni di esercizio troppo elevate; 2. punto di ebollizione sufficientemente elevato, che ne eviti la volatilizzazione; 3. polarità maggiore dei soluti, per evitare dei t R troppo elevati La serie eluotropa dei solventi e le loro principali proprietà chimico-fisiche sono riportate nella tabella successiva (in rosso i solventi più utilizzati nella LC di partizione).

42 SOLVENTE INDICE DI RIFRAZIONE VISCOSITA (cP) PUNTO DI EBOLLIZIONE (°C) INDICE DI POLARITA (P) fluoroalcani1,27-1,290,4-2, < - 2 n -esano 1,3720,30690,1 cicloesano1,4230,90810,2 1-clorobutano1,4000,42781,0 tetraclorometano1,4570,90771,6 i -propiletere 1,3650,38682,4 toluene1,4940,551102,4 etere etilico1,3500,24352,8 tetraidrofurano1,4050,46664,0 cloroformio1,4430,53614,1 etanolo1,3592,08784,3 acetato di etile1,3700,43774,4 diossano1,4201,201014,8 metanolo1,3260,54655,1 acetonitrile1,3410,34825,8 nitrometano1,3800,611016,0 glicole dietilenico1,43116,51826,9 acqua1,3330, ,2

43 Considerando che lindice di polarità varia da – 2 (fluoroalcani) a 10,2 (acqua), si può ottenere qualunque indice di polarità entro questi due estremi, miscelando solventi diversi. Per una fase mobile binaria (A e B) lindice di polarità è espresso dalla formula: dove: P A = indice di polarità del solvente A P B = indice di polarità del solvente B % = percentuali in volume di A e B nella miscela Per ottimizzare il fattore di capacità k si agisce sullindice di polarità P della fase mobile: una variazione di 2 unità di P produce approssimativamente la decuplicazione di k, come si deduce dalla relazione: Dove e sono i valori iniziali e finali di k di un dato soluto e e sono i corrispondenti valori di P. Si può facilmente verificare che se - = 2, il fattore di capacità = 10. Infatti: Giorgio Bonaga

44 Se la polarità della fase mobile è troppo prossima a quella dei soluti (oppure se le interazioni tra i soluti e la fase stazionaria sono troppo deboli), si avranno dei k prossimi a 1 ed i soluti eluiranno in modo così veloce da penalizzare la separazione. Se la polarità della fase mobile è troppo diversa da quella dei soluti (oppure se le interazioni tra i soluti e la fase stazionaria sono troppo forti), si avranno dei K > 10 ed i soluti eluiranno così lentamente da produrre un allargamento ed abbassamento dei picchi che penalizza la sensibilità. La conclusione ovvia è che la polarità dei soluti deve essere intermedia tra quella della fase stazionaria e quella della fase mobile. Infatti: se polarità soluti > polarità fase mobile la affinità per fase mobile > affinità per fase stazioanria (t R = t 0 ) se polarità soluti affinità per fase mobile (t R ) Con l eluizione a gradiente, piccole variazioni della composizione della fase mobile possono produrre grandi variazioni dei t R dei soluti e questo è il motivo principale per formulare una prima considerazione: la straordinaria influenza della polarità della fase mobile sul risultato del processo separativo rende la LC la tecnica di separazione più complessa e sempre suscettibile di continue ottimizzazioni. Giorgio Bonaga

45 SELETTIVITA DELLA FASE MOBILE Se si diagramma il valore del logaritmo di k in funzione della percentuale di solvente organico presente nella fase mobile (es.: acqua/metanolo), si ottiene una retta il cui andamento dimostra che allaumento della percentuale di metanolo diminuisce il valore di k e pertanto diminuisce il tempo di ritenzione di un generico soluto A. Lintercetta sullasse y è il logaritmo di k in acqua pura, quella sullasse x il logaritmo di k in metanolo puro. Un altro soluto B darà origine ad una retta di diversa pendenza, in relazione allintensità delle interazioni soluto/solvente. Giorgio Bonaga CH 3 OH ln k soluto A soluto B x y

46 Lespressione che correla i fattori di capacità k della fase mobile e dellacqua è: k fase mobile = k acqua. e S (%) Con: e = costante di Nepero (= 2,718) S = costante di selettività della fase mobile per un dato soluto In forma logaritmica lespressione diventa: ln k fase mobile = ln k acqua - S (%) ESEMPIO Se la k dellacqua è 10, qualè la k del metanolo ? ln k met = ln 10 – 4 /100 = 2,303 – 0,04 = 2,253 da cui k met = 9,52 Giorgio Bonaga SOLVENTES metanolo3-4 acetonitrile5-6 tetraidrofurano8-9

47 Maggiore è S maggiore è la differenza di polarità tra il solvente organico e lacqua. In una miscela binaria, a parità di composizione percentuale del solvente organico, quello con S maggiore determina t R minori. Giorgio Bonaga k 10 S 9,5 H 2 O CH 3 OH CH 3 CN THF 9,52 9,42 9,15 1,00

48 ESEMPIO t R (H 2 O/CH 3 OH, 50% v/v) > t R (H 2 O/CH 3 CN, 50% v/v) > t R(H 2 O/THF, 50% v/v) È anche possibile stabilire quale composizione devono avere due fasi mobili diverse, costituite da acqua e solvente organico, per avere lo stesso k. % solvente organico A = % solvente organico B. S A /S B ESEMPIO Per avere lo stesso k di una soluzione al 10% di THF in acqua, quale deve essere la percentuale di metanolo in acqua ? % metanolo = 10%. 9/4 = 22,5 % Utilizzando le differenze di selettività S per soluti diversi è possibile ottimizzare la separazione dei costituenti una miscela. Una grande selettività S indica anche che ad una piccola variazione della composizione percentuale di quel solvente corrisponde una grande variazione del fattore di capacità k. Giorgio Bonaga

49 ESEMPIO Supponiamo di operare con una colonna riempita con fase stazionaria a fase legata C18 (non polare) e che la miscela da separare sia costituta dai seguenti soluti (in ordine di polarità crescente): eluendo con acqua:metanolo = 76:24 (P 9) si ottiene il tracciato 1, nel quale è evidente leccessiva separazione dei picchi e i t R troppo elevati, a causa di una percentuale troppo alta di acqua. eluendo con acqua:metanolo = 37:63 (P 6) o acqua:metanolo = 18:82 (P 7) si ottengono i tracciati 2 e 3 nei quali è altrettanto evidente la scarsa separazione dei picchi e i t R troppo bassi, a causa di una percentuale troppo elevata di metanolo. Eluendo con acqua:metanolo = 57:43 (P 8) si ottiene il tracciato 4, dal quale si desume che il rapporto percentuale dei due solventi è ottimale, sia per la separazione dei soluti che per i loro t R uracile fenolo benzaldeide nitrobenzene benzoato di metile Giorgio Bonaga

50 acqua:metanolo = 76:24 (P = 9,078) acqua:metanolo = 57:43 (P = 8,007) acqua:metanolo = 37:63 (P = 6,987) acqua:metanolo = 18:82 (P = 6,018) P TEMPI DI RITENZIONE ,69,823,037,068,0 61,71,8 1,9 2,0 2,1 71,42,3 3,0 3,8 5,0 81,34,2 7,012,018,0 Giorgio Bonaga

51 c. TEMPERATURA In generale la temperatura ha scarsa influenza sulle separazioni nella cromatografia liquida. Pur tuttavia un aumento di T produce una diminuzione dei t R perché diminuisce laffinità con la fase stazionaria. Laumento di temperatura determina anche la riduzione della viscosità della fase mobile e dunque, a parità di flusso, occorre meno pressione delle pompe. Giorgio Bonaga t R (min) T (°C) 3,6 3,0 2,4

52 Infine laumento di temperatura incrementa la velocità della diffusione e dei trasferimenti di massa; la prevalenza di questi ultimi produce un non trascurabile aumento del numero di piatti teorici della colonna. Giorgio Bonaga N T (°C)


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