CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC)

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1 CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC)
L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo di: Chimica analitica strumentale (4 CFU) Giorgio Bonaga CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC) (CAS-4b) Giorgio Bonaga

2 6. TECNICHE DI SEPARAZIONE
Le fasi stazionarie in HPLC sono costituite da particelle di silice (più raramente allumina) che funzionano da ADSORBENTI (cromatografia di adsorbimento = LSC) o da SUPPORTO (cromatografia di partizione = LLC). La diffusione della silice è giustificata da alcune sue proprietà specifiche: è in grado di sopportare pressioni molto elevate (> 1000 atm); è chimicamente stabile verso tutti i solventi a pH non superiore a 8; è facilmente funzionalizzabile (derivatizzabile); è facile ottenerla sottoforma di particelle uniformi; è disponibile in varie dimensioni e porosità ( Å). Nella Bonded Phase Chromatography (BPC), che è una cromatografia di partizione, le particelle di supporto sono legate a dei composti organici. Nella Size Exclusion Chromatography (SEC) le particelle di supporto hanno una porosità controllata e separano i soluti in funzione della loro dimensione molecolare (che è cosa diversa dal loro peso molecolare). Nella Ion Exchange Chromatography (IEC) i gruppi ionici (cationici od anionici) sono legati chimicamente alla superficie del supporto. Giorgio Bonaga 2

3 DIMENSIONE MOLECOLARE (STRUTTURA)
E PESO MOLECOLARE N,N,N-triottilammina C24H51N mol wt 353 PORO acido arachidonico C24H42O2 mol wt 362 Giorgio Bonaga 3

4 b. ELUIZIONE A GRADIENTE
La complessità della correlazione soluto/fase stazionaria/fase mobile rende conto del perché, in generale, in tutte le tecniche di separazione LC si utilizza una grandissima varietà di solventi; la polarità della fase mobile, anche se non è l’unico, è il più importante fattore che produce una migliore solvatazione del soluto e dunque una più veloce eluizione. Questa necessità di variare la composizione della fase mobile per ottimizzare le separazioni dei soluti è alla base della classificazione delle tipologie di eluizione della LC: ELUIZIONE ISOCRATICA La composizione della fase mobile rimane costante per tutto il tempo dell’eluizione. b. ELUIZIONE A GRADIENTE La composizione della fase mobile viene fatta variare durante l’eluizione (con aumento della percentuale del solvente più polare), allo scopo di separare tutti i soluti, anche quelli che hanno fattori di capacità (k’) molto diversi. Giorgio Bonaga 4

5 A) CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO (Liquid Solid Chromatography)
FASE MOBILE: liquido FASE STAZIONARIA: solido adsorbente La separazione si basa sull’assorbimento dei soluti sulla superficie della fase stazionaria, dotata di siti attivi che danno luogo a interazioni non specifiche (forze di dispersione di Van der Waals) e specifiche (legami idrogeno, interazioni dipolo-dipolo). Le fasi stazionarie adsorbenti più utilizzate nella LSC sono la silice (SIO2) e l’allumina (Al2O3), anche se la silice è preferita per la sua maggiore capacità di carica, ma anche perché è attiva sia con i gruppi silanolici liberi (fase diretta) che con i gruppi silanolici funzionalizzati (fase inversa). I siti attivi della fase stazionaria sono sempre ricoperti da molecole del solvente (solvatazione della fase stazionaria), così come il solvente circonda le molecole di soluto (solvatazione del soluto). Il soluto proveniente dalla fase mobile “sposta”, per competizione, dalla superficie della fase stazionaria un certo numero di molecole di solvente. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari Giorgio Bonaga 5

6 stazionaria assorbente
LSC IN FASE DIRETTA Sm Sa Sa Sm Mm H Mm H O Mm H O O Mm O particella di fase stazionaria assorbente (frammento) Ma H soluto O H Ma O solvente H Giorgio Bonaga 6

7 Sm = soluto nella fase mobile (= 3)
Ponendo: Sm = soluto nella fase mobile (= 3) Ma = solvente adsorbito sulla fase stazionaria (= 6) Sa = soluto adsorbito sulla fase stazionaria (= 2) Mm = solvente che passa nella fase mobile (= 4) L’equilibrio : Sm + Ma Sa + Mm è espresso da: Kads = Nell’esempio dell’animazione: Kads = = 0,44 [Sa] . [Mm] [Sm] . [Ma] [2] . [4] [3] . [6] Giorgio Bonaga 7

8 Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari
a. FASE STAZIONARIA Nella cromatografia di adsorbimento la fase stazionaria solida più utilizzata è la silice, con due modalità di impiego: silice tal quale (fase diretta) con i gruppi silanolici liberi: a) i soluti polari sono molto adsorbiti e per eluire con tR ragionevoli richiedono una fase mobile di polarità intermedia; b) i soluti non polari non sono adsorbitii ed eluiscono con tR confrontabili con quelli dei solventi (tailing); silice funzionalizzata (fase inversa) con gruppi silanolici derivatizzati: a) i soluti non polari sono molto adsorbiti e per eluire con tR ragionevoli richiedono una fase mobile a bassa polarità; b) i soluti polari non sono adsorbiti ed eluiscono con tR confrontabili con quelli dei solventi. Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari FASE DIRETTA soluto non polare solvente Giorgio Bonaga 8

9 Le particelle di silice sono di due tipi:
Giorgio Bonaga Le particelle di silice sono di due tipi: particelle irregolari a corpo poroso, con diametro compreso tra 5-60 mm; particelle regolari con strato poroso di 1-2 mm (pellicolare), con diametro compreso tra mm; 40-60 mm irregolare a corpo poroso 40 mm regolare pellicolare (2 mm) 5-10 mm irregolare a corpo poroso 10 mm regolare pellicolare (1 mm) 9

10 Nella GSC in fase diretta, la silice va attivata per aumentare il numero di gruppi silanolici, normalmente presenti in quantità limitata rispetto i gruppi silossanici. L’attivazione si fa trattando con una soluzione 1M di HCl all’ebollizione per ore. I gruppi silosssanici presenti nello strato pellicolare esterno nelle particelle di grandi dimensioni e all’interno dei canalicoli delle particelle di piccole dimensioni si idrolizzano parzialmente in gruppi silanolici. Per eliminare l’acqua di idrolisi, che si lega con legami idrogeno ai gruppi silanolici, si essica in stufa non oltre i 200°C per evitare che i gruppi silanolici si ricondensino in gruppi silossanici. gruppo silossanico gruppo silanolico (pKa  9) gruppi silanolici geminali Giorgio Bonaga 10

11 I soluti vengono adsorbiti sui siti attivi della fase stazionaria in funzione della loro polarità ed è il gruppo funzionale più polare che determina il tempo di eluizione (di ritenzione) di un soluto. Un altro elemento strutturale importante è il numero e la posizione dei gruppi funzionali, perché influenza il numero di interazioni soluto/fase stazionaria. H O O H idrochinone catecolo COMPETIZIONE H O H O H O H O Si Si Si Si O O O O Giorgio Bonaga 11

12 o < m < p ESEMPIO o - - - o m p
Qual’è l’ordine di eluizione dei 3 isomeri di posizione della nitroanilina in una LSC ? Giorgio Bonaga Le strutture dei tre isomeri mostrano che l’o-nitroanilina (1) forma legami idrogeno intramolecolari che, impegnando i gruppi funzionali, riduce l’interazione con la fase stazionaria. La m-nitroanilina (2), per motivi di geometria strutturale può interagire con uno soltanto dei suoi gruppi funzionali, mentre la p-nitroanilina (3) può interagire con entrambi. La risposta, in ordine di tempo di ritenzione crescente, è: o < m < p o t (sec) p m - + + + - - o m p

13 TEMPI DI RITENZIONE RELATIVI
(silice e allumina) idrocarburi paraffinici CnH2n+2 idrocarburi olefinici CnH2n idrocarburi aromatici C6H5-R alogenuri RX tioeteri (solfuri) R2S eteri ROR nitroderivati RNO2 esteri ≈ chetoni ≈ aldeidi RCOOR, R2CO, RCHO ammine primarie ≈ ammine secondarie RNH2, R2NH alcoli ROH ammidi RCONH2 acidi carbossilici RCOOH (acqua) tR Giorgio Bonaga 13

14 b. FASE MOBILE La forza del solvente della fase mobile è espressa dal calore che si sviluppa quando quel solvente puro interagisce con la fase stazionaria. Questo parametro è detto forza dell’eluente (e°) ed esprime l’energia di adsorbimento del solvente per area unitaria di superficie adsorbente standard. Tanto maggiore è l’interazione tra il solvente e la fase stazionaria tanto maggiore è l’energia che si sviluppa, tanto più elevata è la polarità del sovente e tanto più alta è la sua forza eluente. L’elenco dei valori di e° si chiama serie eluotropica per una certa fase stazionaria. Un aumento di e° di 0,05 unità produce una diminuzione di tutti i valori di k’ di un fattore compreso tra 3 e 4 . La corretta combinazione tra solventi a differente e° determinerà tempi di ritenzione adeguati alla separazione dei soluti. Sfortunatamente e° non varia linearmente con i rapporti volumetrici e pertanto la scelta della combinazione ottimale dei solventi della fase mobile è un po’ più complessa (sono disponibili diagrammi di correlazione tra e° e la combinazione di un certo numero di fasi mobili binarie di comune impiego). Nel caso di “overlapping” di picchi, se si sostituisce un solvente con un altro, in modo da mantenere più o meno costante il fattore di capacità k’, si ottiene una variazione del fattore di selettività a che consente la risoluzione dei picchi sovrapposti. Giorgio Bonaga 14

15 SERIE ELUOTROPICA PER ALLUMINA(*)
Giorgio Bonaga SOLVENTE e° pentano 0,00 dicloroetilene 0,49 etere di petrolio 0,01 butanone 0,51 esano diossano 0,56 cicloesano 0,04 acetone tetraclorometano 0,18 acetato di etile 0,58 xilene 0,26 dimetilsolfossido 0,62 toluene 0,29 acetonitrile 0,65 clorobenzene 0,30 piridina 0,71 benzene 0,32 iso-propanolo 0,82 etere etilico 0,38 n-propanolo cloroformio 0,40 metanolo 0,95 diclorometano 0,42 acido acetico 1,00 tetraidrofurano 0,45 acqua elevata (*) per la silice i valori della forza eluente (e°) riferiti all’allumina vanno moltiplicati per 0,8. 15

16 b. ELUIZIONE A GRADIENTE
ELUIZIONE ISOCRATICA La composizione della fase mobile rimane costante per tutto il tempo dell’eluizione. b. ELUIZIONE A GRADIENTE La composizione della fase mobile varia durante l’eluizione (con aumento della percentuale del solvente più polare), allo scopo di separare tutti i soluti, anche quelli che hanno fattori di capacità (k’) molto simili. con fase mobile debole i soluti che interagiscono debolmente con la fase stazionaria vengono separati ed eluiscono con tempi di ritenzione normali, ma quelli che interagiscono fortemente eluiscono con tempi di ritenzione eccessivi (con notevole allargamento dei picchi); con fase mobile forte i soluti che interagiscono debolmente eluiscono rapidamente con tempi di ritenzione troppo ridotti (nel “tailing” del solvente), mentre quelli che interagiscono fortemente vengono separati ed eluiscono con tempi di ritenzione normali. con fase mobile a gradiente di polarità si ottiene l’eluizione con i tempi di ritenzione ottimali per tutti i soluti. Giorgio Bonaga 16

17 EFFETTI DELLA FORZA DEL SOLVENTE SULLA SEPARAZIONE
2 1 SOLVENTE DEBOLE 3 4 1+2 3 4 5 6 SOLVENTE FORTE 1 3 2 4 SOLVENTE INTERMEDIO 5 6 1 2 3 4 5 6 GRADIENTE DI SOLVENTE Giorgio Bonaga

18 R cis trans La LSC è una tecnica adatta per separare:
soluti con mol. wt < 5000 soluti solubili in solventi non polari soluti omologhi soluti isomeri Attualmente la LSC viene molto utilizzata nei processi di estrazione (SPE = Solid Phase Extraction) di microcomponenti da matrici complesse di mezzi acquosi, anche grazie alla vasta gamma di adsorbenti solidi a base di silice funzionalizzata (fase inversa, fase diretta, scambio ionico), piuttosto che nei processi di separazione. H R cis trans Giorgio Bonaga 18

19 SEPARAZIONE DI ISOMERI GEOMETRICI
H 3 C O O C H N 3 N N N 1 trans-3,4 difenil-3-acetil-pirazolina 2 cis-3,4 difenil-3-acetil-pirazolina 1 3 2 t (min) COLONNA: 1000 mm x 3,0 mm i.d. FASE STAZIONARIA: silice pellicolare 10 mm ELUIZIONE ISOCRATICA: CH2Cl2/iso-C8H18=50/50 DETECTOR: UV 254 mm Giorgio Bonaga 19

20 SEPARAZIONE DI XANTINE ESTRATTE DA SIERO DI SANGUE
C H O H O C H O C H C H O H 3 3 2 2 H C 3 N H C N H H C 3 N 3 N N N 2 N N N N N N O N O N O N O N C H C H C H 3 3 3 C H 3 caffeina teofillina teobromina N-idrossietil-teofillina 4 1 Giorgio Bonaga 3 t (min) COLONNA: 50 mm x 4,6 mm i.d. FASE STAZIONARIA: silice 5 mm ELUIZIONE ISOCRATICA: CHCl3/C7H16/C2H5OH/CH3COOH=56,3/37,6/6,0/0,1 DETECTOR: UV 254 mm 20

21 B) CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE (Liquid Liquid Chromatography)
FASE MOBILE: liquido FASE STAZIONARIA: liquido (su supporto solido inerte o a fase legata) La separazione si basa sulla ripartizione del soluto tra la fase mobile liquida e la fase stazionaria (liquido su supporto solido inerte o film di gruppi organici legati chimicamente al supporto solido inerte). Questa distinzione comporta una prima classificazione della LC di partizione: a fase legata (BPC = Bonded Phase Chromatography) a fase non legata (LLC = Liquid Liquid Chromatography) Giorgio Bonaga 21

22 CROMATOGRAFIA A FASE LEGATA (BPC)
Ha quasi completamente sostituito la più tradizionale cromatografia liquido-liquido (con la quale si ha perdita di fase stazionaria ed è difficile operare con eluizioni a gradiente). I gruppi organici che si fissano chimicamente sulla superficie del supporto possiedono una certa mobilità conformazionale che conferisce loro un comportamento simile a quello di un liquido (stato pseudo-liquido). La BPC può essere: FASE MOBILE: polare (H2O, CH3OH, CH3CN) IN FASE INVERSA FASE STAZIONARIA: non polare ( Si-O-SiR3) SOLUTI: non polari FASE MOBILE: non polare (nC6H14, Et2O, CHCl3) IN FASE DIRETTA FASE STAZIONARIA: polare ( Si-OH) SOLUTI: polari Giorgio Bonaga 22

23 CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA
Reverse Phase Chromatography (RPC) Si fase mobile (polare) Si Si Si Si Si Si fase stazionaria (non polare) Giorgio Bonaga 23

24 CROMATOGRAFIA IN FASE DIRETTA
Normal Phase Chromatography (NPC) fase mobile (non polare) Si Si Si fase stazionaria (polare) Giorgio Bonaga 24

25 CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA CROMATOGRAFIA IN FASE DIRETTA
FASE MOBILE: elevata polarità FASE MOBILE: bassa polarità A B C B C A FASE MOBILE: media polarità FASE MOBILE: media polarità A B C C B A POLARITA’ DEI SOLUTI: A >B > C Giorgio Bonaga 25

26 CROMATOGRAFIA IN FASE INVERSA (Reverse Phase Chromatography)
a. FASE STAZIONARIA Si utilizzano materiali diversi: silice allumina carbone pirolitico polimeri (polietilene) e copolimeri (stirene/divinilbenzene) La silice è il materiale più utilizzato perché la tecnologia attuale consente di ottenere particelle di dimensioni e porosità controllate, oppure particelle con uno strato pellicolare poroso. Inoltre è il materiale che può essere più facilmente funzionalizzato. Giorgio Bonaga silice allumina carbone pirolitico resine 26

27 FUNZIONALIZZAZIONE DELLA SILICE
Giorgio Bonaga FUNZIONALIZZAZIONE DELLA SILICE Il trattamento con HCl a riflusso produce l’idrolisi dei gruppi silossanici superficiali con formazione di gruppi silanolici, mentre con il riscaldamento a 200°C si elimina l’acqua di idrolisi senza produrre la ricondensazione dei gruppi silanolici in gruppi silossanici. La superficie porosa del supporto consente una migliore adesione della fase legata. Ai gruppi silanolici così ottenuti si possono legare composti organici diversi, con quattro meccanismi di reazione differenti (funzionalizzazione). poro gruppo silanolico silice al microscopio elettronico gruppo silossanico 27

28 1. Esterificazione (fase etere)
La silice viene riscaldata a riflusso in sospensione con alcoli alifatici (decanolo) anche se, essendo una reazione di equilibrio, si forma solo parzialmente il decanossi-silicato (peraltro instabile). + 2. Dialchilamminazione (fase dialchilammina) La silice viene riscaldata a riflusso in sospensione con cloruro di tionile e il cloro-silicato che si forma viene fatto reagire con un’ammina secondaria. Il dialchilammino-silicato che si forma è più stabile de decanossi-silicato, ma in ambiente acido si ha la protonazione dell’ammina con scissione del legame Si-N. + + HCl + SO2 + + HCl Giorgio Bonaga 28

29 3. Alchilazione (fase idrocarburica)
Il cloro-silicato ottenuto in condizioni anidre viene fatto reagire in condizioni anidre con reattivo di Grignard; seppure con una resa bassa si forma un alchil-silicato. + R-Mg-Br + Cl-Mg-Br 4. Silanizzazione (fase silossanica) La silice, in sospensione con un solvente non polare anidro (esano o toluene), viene fatta reagire a riflusso con un agente silanizzante, mantenendo la miscela in ebollizione. L’agente silanizzante, in realtà, può essere un trialchilclorosilano (R3SiCl), un dialchildiclorosilano (R2SiCl2) o un alchiltriclorosilano (RSiCl3). Il primo agente silanizzante produce una funzionalizzazione a fase monomerica (i sostituenti alchilici sono sullo stesso atomo di silicio), con una resa del 50% circa. Il secondo e terzo agente silanizzante producono una funzionalizzazione a fase polimerica (i sostituenti alchilici sono su atomi di silicio vicinali), con un resa rispettivamente del 100% e del 50% circa. La funzionalizzazione a fase monomerica conferisce una maggior mobilità conformazionale alla catena idrocarburica e dunque un più spiccato carattere [pseudo]liquido alla fase legata. + + HCl 29

30 TRIALCHILCLOROSILANO
(fase monomerica) R Cl Si R Cl Si R Cl Si R Si Giorgio Bonaga 30

31 DIALCHILDICLOROSILANO
(fase polimerica) R Cl Si R Cl Si R Si Giorgio Bonaga 31

32 ALCHILTRICLOROSILANO
(fase polimerica) R Cl Si R Cl Si R Si Cl OH idrolisi OH Giorgio Bonaga 32

33 50% da silanizzazione 50% da “end capping”
La funzionalizzazione della superficie di silice conferisce proprietà caratteristiche alla fase stazionaria, ma la grande polarità dei gruppi silanolici residui (da 8 mmoli/m2 la silanizzazione li riduce a 4 mmoli/m2, con una resa di circa il 50%) può perturbare queste proprietà acquisite. È il motivo per cui si opera una definitiva silanizzazione (“end-capping” o “capping off”) con trimetilclorosilano (TMS), che funzionalizza tutti i gruppi silanolici residui con un agente a fase monomerica. Esempio La prima silanizzazione con ottadecildimetilclorosilano e l’end-capping con trimetilclorosilano producono una silice funzionalizzata: 50% da silanizzazione 50% da “end capping” I materiali alternativi alla silice (carbone attivo, polietilene, copolimeri stirene/divinilbenzene) sono non polari e dunque non consentono le reazioni di funzionalizzazione. 33

34 I gruppi legati alla silice che più frequentemente vengono utilizzati sono:
ottadecil - ottil - etil - fenil - cianoetil - idrossietil - A FASE DIRETTA amminoetil - POLARITA’ 34

35 La conformazione delle catene dei gruppi legati può essere a palizzata, a pelliccia ed irregolare. La più efficiente è quella a pelliccia, ma in realtà la disposizione dipende dalla fase mobile impiegata. Ad esempio, con C18 e fase mobile non polare si ottiene quella a pelliccia , mentre con fase mobile polare si ottiene quella a palizzata. Ovviamente con fase mobile fatta di solventi non polari/polari si passa da una conformazione all’altra. a palizzata a pelliccia irregolare 35

36 La fase stazionaria a base di silice nella cromatografia di ripartizione deve essere meno polare dei soluti, ma se la fase è legata dev’essere simile ai soluti. La ripartizione è un fenomeno complesso di competizioni tra le interazioni soluto/fase stazionaria e soluto/fase mobile, il cui bilancio finale (unitamente alla temperatura e alla pressione di esercizio) determinano i tempi di ritenzione dei soluti e, in definitiva, la possibilità di separare i componenti di una miscela. SOLUTI FASE STAZIONARIA composti aromatici silice fenilica dioli e zuccheri silice cianoetilica silice amminoetilica alcoli a basso peso molecolare silice-C8 silice-C2 acidi grassi silice-C18 36

37 INTERAZIONI SOLUTO/SOLVENTE
I tre soggetti attivi nel processo di separazione sono il soluto, la fase mobile e la fase stazionaria. Le interazioni tra soluto/solvente sono preliminari alla comprensione dei principi che governano la scelta della composizione ottimale della fase mobile per separare i componenti di una miscela. interazioni dipolo istantaneo/dipolo istantaneo: dovute all’induzione tra solventi non polari (es.: cloroformio) e soluti non polari (es.: decano). d+ d- d+ d- CHCl3 CH3-(CH2)8-CH3 2. interazioni dipolo permanente/dipolo permanente: dovute all’induzione tra solventi polari (es.: acetonitrile) e soluti polari (es.: aldeide). d+ d- C H O R = CH3-C N d+ d- Giorgio Bonaga 37

38 3. legami idrogeno: dovuti all’interazione tra un solvente (es
3. legami idrogeno: dovuti all’interazione tra un solvente (es.: acqua) contenente un atomo di idrogeno legato a un atomo ad elevata elettronegatività (N, O, F) e un soluto (es.: ammina secondaria) contenente un atomo ad elevata elettronegatività (N, O, F) con una coppia di elettroni di non legame. d- d+ .. H R O H N R H 4. interazioni dielettriche: dovute all’interazione tra solventi ad elevata costante dielettrica (e) e soluti elettricamente carichi (ioni positivi e negativi). d+ d+ d- d- + d+ d- d- d+ d- d- d+ d+ Giorgio Bonaga 38

39 b. FASE MOBILE Nella LC di ripartizione è il fattore di capacità k’ quello più facile da modificare perché k’ dipende essenzialmente dalla composizione della fase mobile. Il “range” ideale del k’ è compreso tra 2 e 10, ma per miscele molto complesse l’intervallo può estendersi da 0,5 a 20. Solo dopo aver ottimizzato il k’ si può agire sul fattore di selettività a (a questo punto modificando la sola fase stazionaria) e, infine, sul fattore di efficienza N (utilizzando una colonna di lunghezza maggiore o di diametro interno minore). Nella cromatografia liquida di ripartizione oggi più utilizzata, la RPC (fase stazionaria non polare, fase mobile polare, soluti non polari) l’equilibrio che determina la ritenzione dei soluti è basato sulla “teoria solvofobica”, secondo la quale i soluti “idrofobici” si ripartiscono tra la fase stazionaria e la fase mobile non per effetto delle interazioni attrattive con la fase stazionaria, ma per le interazioni repulsive con la fase mobile. Più precisamente, i soluti poco polari che hanno una repulsione verso la fase mobile occupano lo spazio minimo disponibile nella fase mobile e conseguentemente tenderanno a trasferirsi nella fase stazionaria. Meno polare è il soluto e più polare è la fase mobile tanto maggiore è il trasferimento del soluto nella fase stazionaria e tanto maggiore sarà il suo tempo di ritenzione. Giorgio Bonaga 39

40 RPC: TEORIA SOLVOFOBICA
fase mobile polare soluto poco polare (IDROFOBICO) repulsione soluto/fase mobile fase stazionaria non polare I solventi della fase mobile che interagiscono in modo rilevante con i soluti sono detti “forti” (in termini di maggiore polarità). Nella cromatografia di partizione la “forza” del sovente (che è definita “forza dell’eluente” o e°) nella SLC - è detta indice di polarità (P’). Snyder definisce questo indice come: “la solubilità di una sostanza in tre solventi: diossano (accettore di protoni con basso momento dipolare), nitrometano (accettore di protoni con elevato momento dipolare) e alcol etilico (donatore di protoni con elevato momento dipolare)” Giorgio Bonaga 40

41 La fase mobile deve, idealmente, possedere 3 requisiti:
m = 0,45 D m = 3,50 D m = 1,69 D La fase mobile deve, idealmente, possedere 3 requisiti: bassa viscosità, per evitare pressioni di esercizio troppo elevate; punto di ebollizione sufficientemente elevato, che ne eviti la volatilizzazione; polarità maggiore dei soluti, per evitare dei tR troppo elevati La serie eluotropa dei solventi e le loro principali proprietà chimico-fisiche sono riportate nella tabella successiva (in rosso i solventi più utilizzati nella LC di partizione). Giorgio Bonaga 41

42 SOLVENTE INDICE DI RIFRAZIONE VISCOSITA’ (cP) PUNTO DI EBOLLIZIONE
INDICE DI POLARITA’ (P’) fluoroalcani 1,27-1,29 0,4-2,6 50-174 < - 2 n-esano 1,372 0,30 69 0,1 cicloesano 1,423 0,90 81 0,2 1-clorobutano 1,400 0,42 78 1,0 tetraclorometano 1,457 77 1,6 i-propiletere 1,365 0,38 68 2,4 toluene 1,494 0,55 110 etere etilico 1,350 0,24 35 2,8 tetraidrofurano 1,405 0,46 66 4,0 cloroformio 1,443 0,53 61 4,1 etanolo 1,359 2,08 4,3 acetato di etile 1,370 0,43 4,4 diossano 1,420 1,20 101 4,8 metanolo 1,326 0,54 65 5,1 acetonitrile 1,341 0,34 82 5,8 nitrometano 1,380 0,61 6,0 glicole dietilenico 1,431 16,5 182 6,9 acqua 1,333 0,89 100 10,2 42

43 dove: P’A = indice di polarità del solvente A
Considerando che l’indice di polarità varia da – 2 (fluoroalcani) a 10,2 (acqua), si può ottenere qualunque indice di polarità entro questi due estremi, miscelando solventi diversi. Per una fase mobile binaria (A e B) l’indice di polarità è espresso dalla formula: dove: P’A = indice di polarità del solvente A P’B = indice di polarità del solvente B % = percentuali in volume di A e B nella miscela Per ottimizzare il fattore di capacità k’ si agisce sull’indice di polarità P’ della fase mobile: una variazione di 2 unità di P’ produce approssimativamente la decuplicazione di k’, come si deduce dalla relazione: Dove e sono i valori iniziali e finali di k’ di un dato soluto e e sono i corrispondenti valori di P’. Si può facilmente verificare che se = 2, il fattore di capacità = Infatti: Giorgio Bonaga 43

44 Se la polarità della fase mobile è troppo prossima a quella dei soluti (oppure se le interazioni tra i soluti e la fase stazionaria sono troppo deboli), si avranno dei k’ prossimi a 1 ed i soluti eluiranno in modo così veloce da penalizzare la separazione. Se la polarità della fase mobile è troppo diversa da quella dei soluti (oppure se le interazioni tra i soluti e la fase stazionaria sono troppo forti), si avranno dei K’ > 10 ed i soluti eluiranno così lentamente da produrre un allargamento ed abbassamento dei picchi che penalizza la sensibilità. La conclusione ovvia è che la polarità dei soluti deve essere intermedia tra quella della fase stazionaria e quella della fase mobile. Infatti: se polarità soluti > polarità fase mobile la affinità per fase mobile > affinità per fase stazioanria (tR= t0) se polarità soluti < polarità fase mobile la affinità per fase stazionaria > affinità per fase mobile (tR ) Con l’eluizione a gradiente, piccole variazioni della composizione della fase mobile possono produrre grandi variazioni dei tR dei soluti e questo è il motivo principale per formulare una prima considerazione: la straordinaria influenza della polarità della fase mobile sul risultato del processo separativo rende la LC la tecnica di separazione più complessa e sempre suscettibile di continue ottimizzazioni. Giorgio Bonaga 44

45 SELETTIVITA’ DELLA FASE MOBILE
Se si diagramma il valore del logaritmo di k’ in funzione della percentuale di solvente organico presente nella fase mobile (es.: acqua/metanolo), si ottiene una retta il cui andamento dimostra che all’aumento della percentuale di metanolo diminuisce il valore di k’ e pertanto diminuisce il tempo di ritenzione di un generico soluto A. L’intercetta sull’asse y è il logaritmo di k’ in acqua pura, quella sull’asse x il logaritmo di k’ in metanolo puro. Un altro soluto B darà origine ad una retta di diversa pendenza, in relazione all’intensità delle interazioni soluto/solvente. y soluto A ln k’ soluto B x % CH3OH Giorgio Bonaga 45

46 k’ fase mobile = k’acqua . e S (%)
L’espressione che correla i fattori di capacità k’ della fase mobile e dell’acqua è: k’ fase mobile = k’acqua . e S (%) Con: e = costante di Nepero (= 2,718) S = costante di selettività della fase mobile per un dato soluto In forma logaritmica l’espressione diventa: ln k’ fase mobile = ln k’acqua - S (%) ESEMPIO Se la k’ dell’acqua è 10, qual’è la k’ del metanolo ? ln k’met = ln 10 – 4 /100 = 2,303 – 0,04 = 2, da cui k’met = 9,52 SOLVENTE S metanolo 3-4 acetonitrile 5-6 tetraidrofurano 8-9 Giorgio Bonaga 46

47 k’ 10 1,00 9,52 9,5 9,42 9,15 S H2O CH3OH CH3CN THF Maggiore è S maggiore è la differenza di polarità tra il solvente organico e l’acqua. In una miscela binaria, a parità di composizione percentuale del solvente organico, quello con S maggiore determina tR minori. Giorgio Bonaga 47

48 % solvente organico A = %solvente organico B . SA/SB
ESEMPIO tR (H2O/CH3OH, 50% v/v) > tR (H2O/CH3CN, 50% v/v) > tR(H2O/THF, 50% v/v) È anche possibile stabilire quale composizione devono avere due fasi mobili diverse, costituite da acqua e solvente organico, per avere lo stesso k’. % solvente organico A = %solvente organico B . SA/SB Per avere lo stesso k’ di una soluzione al 10% di THF in acqua, quale deve essere la percentuale di metanolo in acqua ? % metanolo = 10% . 9/4 = 22,5 % Utilizzando le differenze di selettività S per soluti diversi è possibile ottimizzare la separazione dei costituenti una miscela. Una grande selettività S indica anche che ad una piccola variazione della composizione percentuale di quel solvente corrisponde una grande variazione del fattore di capacità k’. Giorgio Bonaga 48

49 ESEMPIO Supponiamo di operare con una colonna riempita con fase stazionaria a fase legata C18 (non polare) e che la miscela da separare sia costituta dai seguenti soluti (in ordine di polarità crescente): eluendo con acqua:metanolo = 76:24 (P’  9) si ottiene il tracciato 1, nel quale è evidente l’eccessiva separazione dei picchi e i tR troppo elevati, a causa di una percentuale troppo alta di acqua. eluendo con acqua:metanolo = 37:63 (P’  6) o acqua:metanolo = 18:82 (P’  7) si ottengono i tracciati 2 e 3 nei quali è altrettanto evidente la scarsa separazione dei picchi e i tR troppo bassi, a causa di una percentuale troppo elevata di metanolo. Eluendo con acqua:metanolo = 57:43 (P’  8) si ottiene il tracciato 4, dal quale si desume che il rapporto percentuale dei due solventi è ottimale, sia per la separazione dei soluti che per i loro tR. Giorgio Bonaga uracile fenolo benzaldeide nitrobenzene benzoato di metile 49

50 1 2 3 4 acqua:metanolo = 76:24 (P’ = 9,078) acqua:metanolo = 18:82
acqua:metanolo = 76:24 (P’ = 9,078) 1 12345 acqua:metanolo = 18:82 (P’ = 6,018) 2 P’ TEMPI DI RITENZIONE 1 2 3 4 5  9 1,6 9,8 23,0 37,0 68,0  6 1,7 1,8 1,9 2,0 2,1  7 1,4 2,3 3,0 3,8 5,0  8 1,3 4,2 7,0 12,0 18,0 10 12345 acqua:metanolo = 37:63 (P’ = 6,987) 3 10 acqua:metanolo = 57:43 (P’ = 8,007) 4 Giorgio Bonaga 50

51 c. TEMPERATURA In generale la temperatura ha scarsa influenza sulle separazioni nella cromatografia liquida. Pur tuttavia un aumento di T produce una diminuzione dei tR perché diminuisce l’affinità con la fase stazionaria. L’aumento di temperatura determina anche la riduzione della viscosità della fase mobile e dunque, a parità di flusso, occorre meno pressione delle pompe. 3,6 3,0 2,4 tR (min) T (°C) Giorgio Bonaga 51

52 Infine l’aumento di temperatura incrementa la velocità della diffusione e dei trasferimenti di massa; la prevalenza di questi ultimi produce un non trascurabile aumento del numero di piatti teorici della colonna. 12000 8000 4000 N T (°C) Giorgio Bonaga 52