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DIFFUSIONE Una banda di soluto si muove attraverso una colonna cromatografica. Idealmente, una banda infinitamente stretta iniettata allinizio della colonna,

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Presentazione sul tema: "DIFFUSIONE Una banda di soluto si muove attraverso una colonna cromatografica. Idealmente, una banda infinitamente stretta iniettata allinizio della colonna,"— Transcript della presentazione:

1 DIFFUSIONE Una banda di soluto si muove attraverso una colonna cromatografica. Idealmente, una banda infinitamente stretta iniettata allinizio della colonna, emerge alluscita con una forma gaussiana (in condizioni meno ideali la banda diviene asimmetrica). Una delle principali cause dellallargamento della banda è la DIFFUSIONE dovuto al flusso (J) della sostanza da una zona a maggiore concentrazione ad una a minore concentrazione. D = coefficiente di diffusione Segno negativo perché il flusso netto va da una zona a maggiore ad una a minore concentrazione Profilo gaussiano della banda per effetto della diffusione Equazione del picco gaussiano dev. std del picco

2 È importante sottolineare che i piatti non esistono realmente allinterno della colonna, sono solo un modello per facilitare la comprensione del processo che avviene in colonna. Inoltre sono utili per poter valutare lefficienza della colonna. IL MODELLO DEI PIATTI TEORICI Questo modello suppone che la colonna cromatografica contenga un elevato numero di strati detti piatti teorici sui quali si instaura lequilibrio di ripartizione dellanalita tra fase stazionaria e fase mobile. Lanalita si sposta verso la fine della colonna attraverso il movimento della fase mobile, allequilibrio su un piatto, al piatto successivo. EFFICIENZA DELLA COLONNA Se il soluto nella colonna ha percorso una distanza x alla velocità di flusso lineare u x, il tempo che ha trascorso nella colonna sarà t = x/u x. Se per effetto della diffusione la 2 della banda è 2Dt, di conseguenza: Altezza del Piatto Teorico LAltezza del Piatto Teorico è la costante di proporzionalità tra la varianza della banda ( 2 ) e la distanza che essa ha percorso (x)

3 Per un soluto che emerge da una colonna di lunghezza L, il numero di piatti teorici (N) dellintera colonna, è la lunghezza L divisa per lH : Altezza del piatto piccolaPicchi strettiMigliori separazioni Quindi il numero di piatti teorici per una colonna può essere calcolato esaminando un picco cromatografico dopo leluizione. Come si può osservare dallequazione, il numero di piatti della colonna è diverso per ciascun analita nel campione.

4 La teoria cinetica Una descrizione più realistica del processo che avviene allinterno della colonna tiene conto anche del tempo necessario allanalita per il raggiungimento dellequilibrio tra fase stazionaria e fase mobile (nel modello dei piatti teorici si considera che il raggiungimento dellequilibrio è istantaneo) La forma del picco cromatografico è pertanto influenzata dalla velocità di eluizione, ma anche dai cammini preferenziali dellanalita allinterno della fase stazionaria. Considerando i vari meccanismi che contribuiscono allallargamento del picco si arriva alla Equazione di Van Deemter per laltezza del piatto teorico: H = A + B / u + C u dove u è la velocità media della fase mobile mentre A, B, e C sono fattori che contribuiscono allallargamento del picco e sono costanti per una determinata colonna e fase stazionaria A – Diffusione di Eddy. La fase mobile contenente lanalita fluisce attraverso la colonna impaccata con la fase stazionaria, pertanto le molecole di analita seguiranno cammini casuali e differenti allinterno della fase stazionaria. Ciò comporta un allargamento della banda perché i diversi cammini hanno diversa lunghezza e quindi le molecole usciranno in tempi diversi. B/u– Diffusione Longitudinale. Poiché la concentrazione dellanalita è maggiore al centro della banda, lanalita diffonderà dal centro alla periferia determinando un allargamento della banda stessa. Questo effetto è tanto meno pronunciato quanto più elevata è la velocità della fase mobile (lanalita passa meno tempo allinterno della colonna). C u – Resistenza al trasferimento di massa. Se la velocità della fase mobile è elevata e se lanalita ha una forte affinità per la fase stazionaria, lanalita nella fase mobile esce prima dellanalita nella fase stazionaria originando un grande allargamento della banda. Questo effetto è tanto maggiore quanto più è veloce la fase mobile.

5 Risoluzione = 0.5 Risoluzione = 0.75 Risoluzione = 1.00 Risoluzione = 1.50 In cromatografia la RISOLUZIONE fra 2 picchi è definita come: w m = larghezza media dei 2 picchi w 1/2m = larghezza media a metà altezza dei 2 picchi Per lanalisi quantitativa è preferibile una risoluzione uguale o superiore a 1.5

6 È utile mettere in relazione R con il numero di piatti teorici della colonna, i fattori di selettività e i fattori di ritenzione dei due analiti. Lequazione che correla tutti questi parametri è la seguente: Per ottenere unalta risoluzione, è necessario massimizzare i 3 termini. Un aumento del numero di piatti teorici, aumentando la lunghezza della colonna, porta ad un aumento nel tempo di ritenzione, ma può provocare anche un aumento della larghezza della banda. In alternativa per aumentare il numero di piatti si può ridurre laltezza del piatto teorico riducendo la dimensione delle particelle della fase stazionaria. La separazione può essere migliorata controllando il fattore di capacità variando la composizione della fase stazionaria.

7 Un tocco di realismo: bande di forma asimmetrica Il coefficiente di ripartizione K = C s /C m dovrebbe essere costante ed indipendente dalla concentrazione del soluto. Se così fosse avremmo bande simmetriche di forma gaussiana. Nelle colonne reali tuttavia K cambia allaumentare della concentrazione del soluto e le bande si presentano codate. Segnale Tempo Sovraccarico (fronting) K aumenta Segnale Tempo Codatura (tailing) Segnale Tempo IDEALE K diminuisce K = C s /C m = costante Sovraccarico per iniezione di troppo soluto: la banda emerge gradualmente dalla colonna, ma termina bruscamente Alcuni siti della fase stazionaria trattengono il soluto più fortemente di altri: si origina così una codatura prolungata


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