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Cromatografia Generale. Un sistema cromatografico… Si compone di TRE elementi essenziali che lo caratterizzano SEMPRE : Si compone di TRE elementi essenziali.

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Presentazione sul tema: "Cromatografia Generale. Un sistema cromatografico… Si compone di TRE elementi essenziali che lo caratterizzano SEMPRE : Si compone di TRE elementi essenziali."— Transcript della presentazione:

1 Cromatografia Generale

2 Un sistema cromatografico… Si compone di TRE elementi essenziali che lo caratterizzano SEMPRE : Si compone di TRE elementi essenziali che lo caratterizzano SEMPRE : 1. Una fase STAZIONARIA 2. Una fase MOBILE 3. Lanalita (o una miscela di analiti)

3 Cromatografia 1. Analisi antidoping e degli stupefacenti 2. Metabolismo di xenobiotici e farmaci 3. Inquinanti ambientali (aria, terreni, acqua) 4. Analisi DNA, purificazione proteine 5. Analisi degli alimenti 6. Analisi dei profumi e dei cosmetici 7. etc etc.

4 CROMATOGRAFIA La CROMATOGRAFIA interessa la separazione di miscele liquide complesse. La separazione avviene grazie alle differenze nei coefficienti di distribuzione (equilibrio di distribuzione) delle specie chimiche presenti nel campione tra 2 FASI differenti. Una di queste fasi è la fase mobile e laltra è la fase stazionaria. - Stesso principio dellestrazione con solvente !!!

5 Definizione: La diversa affinità di 2 componenti la miscela verso la fase stazionaria determina la separazione cromatografica Concentrazione del componente A nella fase stazionaria Concentrazione del componente A nella fase mobile Coefficiente di distribuzione (Equilibrio di distribuzione ) A mobile A stazionaria K distr = K distr

6 Tipi di Cromatografia 1.Cromatografia Liquida su Colonna (HPLC) 2.Gas Cromatografia (GC) 3. 3.Cromatografia su strato sottile (TLC)

7 Processo Cromatografico

8 Sistemi Cromatografici

9 Tecniche Cromatografiche TLC/PC HPLC GC/SFC PC-Paper Chrom

10 Cromatografia – Meccanismo separazione Adsorbimento Adsorbimento Partizione Partizione Scambio Ionico – Interazione ionica Scambio Ionico – Interazione ionica Esclusione dimensionale Esclusione dimensionale Affinità (interazione anticorpo-antigene; interazione chimica; attrazione) Affinità (interazione anticorpo-antigene; interazione chimica; attrazione) Complessazione - Chelazione Complessazione - Chelazione

11 Problemi di assorbimento!!!!! ASsorbimentoADsorbimento Diversi tipi di assorbimento

12 Adsorbimento PartizioneScambio ionico Cromatografia – Meccanismo di Separazione

13 AffinitàEsclusione dimensionale

14 Cromatogramma – Parametri di base t R = Tempo di ritenzione t m = Tempo morto H 1/2H W 1/2 Picco non trattenuto

15 Teoria Cromatografica Tempo di ritenzione : t R = t R – t M Tempo di ritenzione : t R = t R – t M Teoria dei piatti – distillazione – numero di piatti Teoria dei piatti – distillazione – numero di piatti N = 5.54[(t R – t M )/w 1/2 ] 2 Altezza dei piatti H = L/N Altezza dei piatti H = L/N Questa teoria non tiene conto della interazione degli analiti con la fase stazionaria Questa teoria non tiene conto della interazione degli analiti con la fase stazionaria

16 Cromatografia – Allargamento dei picchi

17

18 Cromatografia - Teoria Teoria delle velocità – fattori cinetici – Teoria delle velocità – fattori cinetici – van Deemter van Deemter H = B/u + Cu (+ A) Dove:u – velocità della fase mobile B – effetto della diffusione molecolare C – resistenza al trasferimento di massa A – allargamento dovuto alla diversa distanza percorsa dalle molecole nelle colonne impaccate

19 Cromatografia – Effetto dellimpaccamento sullallargamento dei picchi

20 Parametri di van Deemter (B) : Diffusione Molecolare (B) – nella fase mobile: Diffusione Molecolare (B) – nella fase mobile: proporzionale al tempo che lanalita passa nella colonna proporzionale al tempo che lanalita passa nella colonna influenzato dal coefficiente di diffusione dellanalita nella fase mobile influenzato dal coefficiente di diffusione dellanalita nella fase mobile influenzato dalla temperatura e pressione influenzato dalla temperatura e pressione poco importante in LC – basso coefficiente di diffusione poco importante in LC – basso coefficiente di diffusione inversamente proporzionale alla velocità della fase mobile inversamente proporzionale alla velocità della fase mobile

21 Parametri van Deemter (C): Resistenza al trasferimento di massa (C): trasferimento di massa nelle fasi stazionaria e mobile trasferimento di massa nelle fasi stazionaria e mobile mancanza di equilibrio – fase mobile mancanza di equilibrio – fase mobile influenzata dallo spessore della fase liquida influenzata dallo spessore della fase liquida inversamente influenzata dal diamentro delle particelle o dal diametro interno della colonna capillare inversamente influenzata dal diamentro delle particelle o dal diametro interno della colonna capillare diminuisce allaumentare della temperatura (viscosità) diminuisce allaumentare della temperatura (viscosità)

22 Parametri van Deemter: Conclusioni: Il più basso valore di H si ottiene quando: Il più basso valore di H si ottiene quando: lo spessore della fase stazionaria è minimo lo spessore della fase stazionaria è minimo la colonna è impaccata con particelle molto fini la colonna è impaccata con particelle molto fini le colonne capillari hanno il diametro più piccolo le colonne capillari hanno il diametro più piccolo la fase mobile e stazionaria mobile hanno bassa viscosità e elevato coefficiente di diffusione la fase mobile e stazionaria mobile hanno bassa viscosità e elevato coefficiente di diffusione

23 Cromatografia – van Deemter Velocità fase mobile Effettomultipercorso Trasferimento di massa Diffusione (Longitudinale) Altezza dei piatti (cm) H Cu A B/u

24 Cromatografia - Risoluzione Response t R1 t R2 t R W b1 R = 2(t R1 – t R2 )/W b1 – W b2 W b2 Baseline resolution for Gaussian shape peaks = %

25 Cromatografia - Risoluzione Equazione per il parametro di risoluzione Equazione per il parametro di risoluzione R s = ½ x ( -1/ +1) x k 2 /1+k 2 x (L/h) 1/2 Dove: – fattore di selettività (separazione) = t R1 /t R2 k – termine di migrazione, fattore di capacità; k – termine di migrazione, fattore di capacità; k = m s /m m L – lunghezza della colonna L – lunghezza della colonna h – altezezza piatto h – altezezza piatto

26 Chromatography - Resolution

27 Cromatografia Analisi Qualitativa Analisi Qualitativa Retention data – RT; R f ; RRT; Kovacs Index Retention data – RT; R f ; RRT; Kovacs Index Analisi Quantitativa Analisi Quantitativa Peak ar ea and height usually proportional to the amount of component Peak ar ea and height usually proportional to the amount of component Calibration Calibration Internal Standard method Internal Standard method External Standard method External Standard method Area Normalization method Area Normalization method

28 Chromatogram – Basic Parameter t R = retention time t m = dead time H 1/2H W 1/2 unretained

29 THE END THE END


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