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Introduzione allanalisi cromatografica. La cromatografia è un metodo analitico largamente utilizzato per la separazione, lidentificazione e la determinazione.

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Presentazione sul tema: "Introduzione allanalisi cromatografica. La cromatografia è un metodo analitico largamente utilizzato per la separazione, lidentificazione e la determinazione."— Transcript della presentazione:

1 Introduzione allanalisi cromatografica

2 La cromatografia è un metodo analitico largamente utilizzato per la separazione, lidentificazione e la determinazione quantitativa dei componenti di miscele complesse I metodi cromatografici sfruttano le diverse affinità delle molecole nei confronti di due fasi diverse: la fase stazionaria e la fase mobile che viene fatta scorrere in modo continuo sulla fase stazionaria I componenti della miscela sono trasportati attraverso la fase stazionaria dalla fase mobile La separazione dei componenti della miscela dipende dalla loro differente velocità di migrazione. In particolare le sostanze più affini alla fase stazionaria sono più trattenute e quindi il loro trascinamento risulta lento. Al contrario sostanze più affini alla fase mobile sono più facilmente eluite

3 Fase mobile Fase stazionaria

4 Da un punto di vista storico, i primi esperimenti cromatografici furono eseguiti dal botanico russo M Tswett nel 1906 (separazione di clorofille usando etere di petrolio come fase eluente e calcio carbonato come fase stazionaria). Le specie separate apparvero come bande colorate e da qui il nome che scelse per la tecnica: dal Greco chroma (colore) e graphein (scrivere)

5 Classificazione dei metodi cromatografici Un metodo di classificazione dei metodi cromatografici si basa sullo stato della fase mobile (liquido – gassoso) cromatografia Cromatografia liquida (fase mobile liquida) Gas cromatografia (fase mobile gassosa) liquido – liquido liquido - solida gas – liquido gas - solida Sulla base dello stato della fase stazionaria si ha una ulteriore suddivisione

6 Le tecniche cromatografiche vengono inoltre classificate in base al meccanismo principale di separazione che interviene: 1) adsorbimento, 2) ripartizione, 3) scambio ionico, 4) esclusione, 5) affinità 1. Adsorbimento: la fase stazionaria è un solido in granuli e la fase mobile può essere un gas o un liquido. La fase stazionaria è in genere un composto inorganico o un polimero organico. Sulla superficie dei granuli si trovano dei siti attivi che possono stabilire legami deboli (interazioni dipolo-dipolo, legami idrogeno, interazione idrofobiche) con le molecole della miscela Fase stazionaria (solido) Fase mobile

7 Possibili interazioni di composti organici con allumina

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9 2. Ripartizione: la fase stazionaria è un liquido (supportato da un solido granulare inerte) in cui le sostanze da separare si solubilizzano. La fase mobile può essere un gas o un liquido e comunque deve essere immiscibile con la fase liquida. Durante leluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente nelle due fasi (stazionaria e mobile) sulla base delle caratteristiche chimiche Fase stazionaria (liquido) Fase mobile supporto

10 Fase stazionaria 3. Scambio ionico:la fase stazionaria è costituita da macromolecole con siti attivi ionizzati (cationici o anionici) i cui controioni possono essere scambiati con ioni aventi carica dello stesso segno ed eluiti dalla fase mobile. Durante leluizione gli ioni presenti nella fase mobile vengono separati gli uni dagli altri in base alla diversa affinità di ciascuno per i siti della fase stazionaria (cromatografia a scambio ionico) Siti attivi controioni Fase stazionaria Fase mobile - Fase stazionaria

11 4. Esclusione: tecnica per la separazione di macromolecole. La fase stazionaria è un solido poroso o, più comunemente, un gel con i pori di dimensioni variabili. Le molecole dellanalita di una determinata dimensione molecolare, penetrano nei pori dove permangono per un certo periodo; le molecole troppo grandi, però, vengono escluse dai pori e perciò escono dalla colonna in tempi brevi (cromatografia di esclusione)

12 Tecniche cromatografiche Cromatografia planare: la fase stazionaria è distribuita su una superficie piana. Le tecniche principali sono la cromatografia su strato sottile (Thin Layer Chormagraphy, TLC) e la cromatografia su carta (paper chromatography)

13 Cromatografia su colonna a bassa pressione : ampiamente utilizzata per separazione di miscele e non per analisi quantitativa

14 Cromatografia in fase liquida ad elevata prestazione (High Performance Liquid Chromatography, HPLC): ampiamente utilizzata per lidentificazione e quantizzazione di molecole. In pratica, la versione strumentale della cromatografia su colonna 1) Fase eluente; 3) sistema di pompaggio; 4) sistema iniezione campione; 5) colonna cromatografica; 6) detector ; 7) scarico; 8) sistema acquisizione dati

15 Colonne HPLC

16 Gascromatografia (Gas Chromatography, GC): Tecnica ampiamente utilizzata per lidentificazione e quantizzazione di molecole volatili.

17 Colonna GC (capillare)

18 Il cromatogramma Le separazioni cromatografiche strumentali (HPLC e GC) si concludono con la registrazione del cromatogramma, ovvero del tracciato del segnale del rivelatore in funzione del tempo o del volume di eluente, a partire dallistante in cui la miscela viene introdotta nella colonna (t=0)

19 Il tracciato completo che si ottiene per ciascuna sostanza eluita è detto picco cromatografico. In condizioni cromatografiche ideali il picco cromatografico ha la forma di una curva gaussiana. Da un punto di vista matematico una curva gaussiana viene descritta dal punto di massimo e dalla distanza tra i punti di flesso (tale distanza diviso 2 è la deviazione std. ( ) Altezza del picco: distanza tra il punto massimo e la tangente alla linea di base Larghezza della base del picco (W): lunghezza del segmento interpolato allintersezione fra le tangenti ai flessi della gaussiana e la linea di base (W b = 4 ) Larghezza a metà altezza: larghezza misurata a metà altezza del picco (W H = ) Distanza fra i punti di flesso: segmento interpolato fra i due punti di flesso (corrsipondente al 60.7% altezza picco ) (W i = 2 ) Area totale sottesa: proporzionale alla concentrazione

20 Il picco cromatografico è inoltre identificato dal tempo di ritenzione (t R ): tempo impiegato da ciascuna sostanza per eluire dalla colonna, misurato a partire dallistante in cui la miscela viene introdotta nello strumento, fino allistante in cui si registra il massimo del picco (in alternativa si può utilizzare il volume di ritenzione). Il tempo morto è il tempo di ritenzione di una sostanza non trattenuta dalla fase stazionaria Il volume morto (V M ) (detto anche volume della fase mobile) corrisponde al volume della colonna non occupato dalla fase stazionaria. Il tempo di ritenzione corretto: tempo che ogni sostanza impiega per le interazioni con la fase stazionaria (t R = t R – t M )

21 Costante di distribuzione Costante di distribuzione (K c ) = CSCS CMCM ove Cs= concentrazione analita nella fase stazionaria e C M = conc nella fase mobile; Ad ogni istante del processo cromatografico le sostanze si distribuiscono fra le due fasi in modo specifico. Supponiamo che ad un tempo t si raggiunga lequilibrio: C M C S La costante di distribuzione è correlata con il volume di ritenzione dalla seguente equazione: V R = V M + K C V S Ove V S è il volume della fase stazionaria. Il valore K C può quindi essere determinato sulla base di V R, V M e V S. Dato tuttavia la difficoltà di determinare in modo accurato V S, si preferisce far riferimento al fattore di ritenzione (k)

22 Fattore di ritenzione nSnS nMnM Fattore di ritenzione o fattore di capacità (k) = Ove n S è il numero di moli nella fase stazionaria e n M nella fase mobile CSVSCSVS CMVMCMVM k = Poiché K C = C S /C M VSVS VMVM k = KCKC K C = VMVM VSVS k Sostituendo K C nella equazione V R = V M + K C V S avremo: V R = V M + kV M

23 e quindi V R = V M (1 + k) se esprimiamo tale equazione in termini di tempi di ritenzione (V= TF) si può scrivere: t R F C = t M F C (1+k) e considerando il flusso costante, Lequazione si semplifica t R = t M (1+k) da cui k= (t R -t M )/t M ovvero: t R tMtM k =

24 Al fine di una buona separazione è necessario che il fattore di ritenzione della sostanza eluita per prima sia maggiore di 1. k non deve inoltre essere superiore a 10-15

25 Risoluzione di una separazione cromatografica Una buona risoluzione cromatografica significa una buona separazione tra i due picchi contigui selettività efficienza

26 La qualità di una separazione cromatografica (risoluzione dei picchi) dipende dalla selettività ed efficienza: la selettività indica la capacità di un sistema cromatografico di eluire specie chimiche a velocità il più possibili diverse ed è espressa dal fattore di separazione = t R2 / t R1 La selettività non è tuttavia suff. per una buona risoluzione cromatografica qualora i picchi sono larghi e tali da sovrapporsi

27 Lefficienza indica la capacità di un sistema cromatografico di eluire tutte le particelle di una specie chimica con la stessa velocità, in modo da formare bande e quindi picchi stretti. Dato che lefficienza esprime lallargamento del picco essa è una espressione di : Deviazione std. relativa R = /t R, dato che tale valore è solitamente piccolo, per motivi pratici, si preferisce calcolare N, detto numero dei piatti o numero dei piatti teorici: Efficienza della colonna N = (t R / ) 2 = 16 (t R / w b ) 2

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29 Valutazione quantitativa dell efficienza di una colonna cromatografica Altezza equivalente al piatto teorico H = L / N Ove L è la lunghezza della colonna (una colonna è tanto più efficiente quanto più H è piccolo) Lefficienza di una colonna dipende da fattori extra-colonna (non incidono più del 10%) e da fattori della colonna. Dei diversi modelli utilizzati per spiegare i fattori della colonna, quello più accreditato è il modello del non-equilibrio di Giddings che individua tre fattori che partecipano allallargamento delle bande: Percorsi multipli diffusione molecolare longitudinale distribuzione di flusso Trasferimento di massa tra le fasi

30 Percorsi multipli: dato che la porosità e limpaccamento della fase stazionaria non sono perfettamente uniformi, si verificano cammini diversi e non equivalenti dellanalita nella fase mobile. Questo comporta che le molecole, pur partendo insieme, percorrano distanze diverse e arrivano al detector a tempi diversi, provocando un allargamento della banda. Per risolvere tale problema è necessario ottenere una distribuzione granulometrica della fase stazionaria molto ristretta.

31 Diffusione di flusso: Il flusso è più veloce al centro che vicino alle particelle Lallargamento da percorsi multipli e da diffusione di flusso è indipendente dalla velocità della fase mobile.

32 Diffusione molecolare longitudinale: Le molecole della sostanza si muovono spontaneamente in direzione longitudinale, sia nel senso di scorrimento della fase mobile sia in quello opposto. Lallargamento della banda per effetto della diffusione molecolare dipende dal tempo di permanenza dellanalita nella fase mobile e dalla diffusitività del soluto. Per minimizzare la diffusione molecolare longitudinale si può aumentare il flusso della fase mobile e agire sulla viscosità delleleuente

33 Trasferimento di massa: Allinizio le molecole di analita più vicine alla fase stazionaria diffondono dalla fase mobile alla fase stazionaria. La velocità di diffusione dipende dalla diffusività dellanalita. Le molecole rimaste nella fase mobile si spostano trascinate dalla corrente delleluente e diffondono nella fase stazionaria in un tratto successivo. Tale processo crea un allargamento della banda. Lo stesso meccanismo di diffusione asimmetrica si instaura per il procedimento inverso (dalla fase stazionaria alla fase mobile) Il trasferimento di massa è un processo che si riduce usando solventi a bassa viscosità (aumento della diffusività dellanalita) ed aumenta allaumentare della velocità della fase mobile. Fase mobile Fase stazionaria Fase mobile Fase stazionaria Fase mobile Fase stazionaria

34 Variabili che influenzano lefficienza della colonna: un modello matematico Andamenti sperimentali tipici della funzione H= f( ū ) ove ū = velocità lineare fase mobile (cm/s) Valore minimo di H (max di efficienza) per valori di ū bassi. H è di un unità di grandezza inferiore in a) ma le colonne non più lunghe di cm contro 50 m di b) quindi molto più efficienti in b). L entità di allargamento di una banda dipende dal tempo in cui fase mobile e fase stazionaria restano in contatto, quindi dipende dalla velocità del flusso. Di conseguenza tutti gli studi di efficienza determinano H in funzione della velocità della fase mobile.

35 Lequazione di Van Deemter La funzione H= f( ū ) può essere descritta da una equazione del tipo: y = a+ b/x + cx e può essere considerata la combinazione lineare di tre equazioni più semplici: y = a y= b/x (iperbole equilatera) y= cx y = a+ b/x + cx y= cx y = a y= b/x

36 H = A + B/ū + C ū Equazione di Van Deemter descrive l efficienza Cromatografica. Primo termine dellequazione (A): A è associato ai percorsi multipli e alla diffusione di flusso (parametri indipendente dal flusso) A= 2 d p Ove è un parametro associato alla granulometria (diametro e distribuzione) d p = diametro medio particelle Per minimizzare questo termine è necessario ridurre il diametro particelle e aumentarne luniformità

37 Secondo termine dellequazione (B/ ū ): Tale termine è associato alla diffusione molecolare longitudinale B= 2 D M Ove è il fattore di tortuosità e dipende dallimpaccamento colonna D M è il coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobile (in HPLC si può trascurare mentre è importante in GC) Per ridurre B si può ridurre (particelle uniformi), ridurre D M e aumentare ū

38 Terzo termine dellequazione (C ū ): Il terzo termine è associato alla resistenza al trasferimento di massa. C = C S + C M Ove C S è il contributo del trasferimento nella fase stazionaria e C M in quella mobile qkd f 2 (1+k) 2 D S CS=CS= q = costante di uniformità particelle fase stazionaria, k= fattore di ritenzione; df = spessore massimo fase stazionaria; D S = coeff. di diffusione d p 2 DMDM CM=CM= d p = spessore massimo fase mobile; D M = coeff. diffusione soluto nella fase mobile

39 Dallequazione di Van Deemter si devono ottimizzare i seguenti parametri: - Flusso fase mobile : si effettua per via sperimentale e costituisce un compromesso; - Caratteristiche fisiche fase mobile: importante per la GC (il termine B contribuisce notevolmente) – la fase gassosa deve avere una elevata densità - diametro delle particelle della fase stazionaria – importante uniformità e ridotto diametro delle particelle

40 Risoluzione La risoluzione indica il grado di separazione dei picchi e dipende dalla selettività ed efficienza. In termini matematici la risoluzione tra due picchi adiacenti (Rs) è espressa dal rapporto fra le loro distanze e la semisomma delle rispettive larghezze alla base t R2 – t R1 w 1 + w 2 2 Rs=Rs=

41 Nel caso reale di picchi asimmetrici, lequazione deve essere modificata ponendo al denominatore la somma dei segmenti a e b, ovvero le due semibasi che si affiancano t R2 – t R1 (a – b) Rs=Rs=

42 Il valore minimo di R s è di 1 (sovrapposizione dei picchi del 4%). Per Rs= 1.5 (sovrapposizione dello 0.3%) la separazione è considerata completa. La risoluzione può essere aumentata allungando la colonna quindi aumentando i piatti teorici.

43 La risoluzione fra due picchi può anche essere posta in relazione con il numero di piatti teorici (N), con la selettività ( ) e con il fattore di ritenzione (k). Rs = 1 4 N2N2 - 1 k2k2 1+k 2 ( () ) Ove N 2 e k 2 si riferiscono al secondo picco (più lento) Variazioni N Variazione del fattore di ritenzione (k) : per fasi mobili gassose si varia la T, per quelle liquide la composizione delleluente Variazione del fattore selettività ( ): la variazione dei due parametri precedenti non è suff. nel caso in cui =1. In tale caso si variano diversi parametri tra cui la fase stazionaria, la fase mobile e la T

44 Aumento di efficienza Scarsa selettività ed efficienza = picchi non risolti Aumento di selettivitàAumento di efficienza ma non di selettività

45 Il problema generale della eluizione

46 HPLC Eluizione isocratica: Composizione fase mobile costante Eluizione a gradiente: Composizione fase mobile variabile nel tempo GC Programmazione di temperatura: Temperatura variabile Condizione isoterma: Temperatura costante

47 Asimmetria dei picchi cromatografici I picchi cromatografici possono avere una forma gaussiana non simmetrica. Si possono avere due tipi di deformazioni: tailing: il tracciato sale bruscamente per scendere lentamente fronting: il tracciato sale lentamente e scende rapidamente

48 Il fattore di simmetria viene espresso dal fattore o rapporto di asimmetria: A s = b/a Ove a e b sono le distanze della curva dalla verticale tracciata nel punto di massimo del picco, misurate in corrispondenza del 10% dellaltezza del picco, rispettivamente a sinistra e destra del punto massimo. Nel caso di tailing A s >1 mentre nel caso di fronting A s <1.

49 Le cause di fronting e tailing possono essere ricondotte ad una di queste cause: Introduzione del campione lenta o comunque scorretta Adsorbimento irreversibile della sostanza nella fase stazionaria sovraccarico Ridotta solubilità del campione nella fase mobile 2 mg 2 µg


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