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PCR Restriction Analysis Il principio hsp65: gene altamente conservato Digestione con un enzima di restrizione specifico per una sequenza nucleotidica.

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Presentazione sul tema: "PCR Restriction Analysis Il principio hsp65: gene altamente conservato Digestione con un enzima di restrizione specifico per una sequenza nucleotidica."— Transcript della presentazione:

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2 PCR Restriction Analysis

3 Il principio hsp65: gene altamente conservato Digestione con un enzima di restrizione specifico per una sequenza nucleotidica non molto frequente Determinazione del pattern dei frammenti di restrizione Confronto con pattern di restrizione appartenenti a specie note

4 Il metodo Amplificazione di una porzione di 439 bp allinterno del hsp65 Digestione dellamplificato usando (separatamente) 2 diversi enzimi di restrizione Separazione elettroforetica dei prodotti di digestione di ciascun enzima Determinazione, per confronto con pesi molecolari noti, delle dimensioni dei frammenti (quelli inferiori a 40 bp vengono ignorati) Uso di un algoritmo per raggiungere lidentificazione di specie

5 I frammenti di restrizione BstEII nessuna digestione (440 bp) produzione di 2-3 frammenti ( bp) HaeIII produzione di 2-5 frammenti ( bp)

6 BstEII

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8 HaeIII

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12 hsp65 PRA: lalgoritmo 320 bp 130 bp 120 bp 200/60/50 bp M. chelonae 150/105 bp M. haemophilum 185/130 bp M. terrae 145/130/50 bp M. simiae 130/115/60 bp M. gordonae 130/95/75/60 bp M. kansasii... BstEII HaeIII Differenziazione delle specie, allinterno del pattern di restrizione prodotto da BstEII, in base al pattern prodotto da HaeIII

13 Sviluppi Determinazione delle dimensioni esatte dei frammenti, mediante sequenziamento Presenza di un sito Internet (PRA-Site) contenente tutti i pattern di restrizione delle specie batteriche note

14 Conclusioni Di facile esecuzione ed economico Svariate specie sono caratterizzate da più di un pattern (fino a 9) Alcune specie hanno pattern indistinguibili


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