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Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare La Citologia Cervico-Vaginale: nuove.

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Presentazione sul tema: "Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare La Citologia Cervico-Vaginale: nuove."— Transcript della presentazione:

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2 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare La Citologia Cervico-Vaginale: nuove tecnologie

3 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare Human Papilloma Virus (HPV): - Papovavirus – Papilloma - DNA circolare con 8000 paia di basi - 2 capsidi proteici - Replica virale (nucleo cell. epit. squamose) - Trasmissione sessuale - Virus epiteliotrofico

4 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare GENOMA VIRALE: - regione regolatoria - regione geni tardivi (L1, L2) - regione geni precoci (E1, E2, E4, E5, E6, E7) - E6 – p53 - E7 – p103, p107

5 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare w Regione REGOLATORIA regola la trascrizione dei geni controllando la produzione di proteine virali e particelle infettive w Regione GENI TARDIVI con due unità trascrizionali, L1- L2 che codificano per le proteine del capside,rispettivamente per il capside maggiore e minore. w Regione GENI PRECOCI con 6 unità trascrizionali dette E1,E2,E4,E5,E6,E7,che codificano per le proteine necessarie alla replica virale.

6 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare Sequenze di particolare interesse sono presenti nella regione precoce E6 - E7 di alcuni genotipi oncogeni. Infatti queste sequenze codificano proteine in grado di interferire con lattività di proteine espresse da geni cellulari oncosoppressori e questo può portare ad una proliferazione cellulare incontrollata e quindi può contribuire ad innescare la progressione neoplastica

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8 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare w In uno striscio cervico vaginale, laspetto morfologico specifico e patognomonico della presenza di HPV, si basa sulla presenza di cellule, definite COILOCITI, che rappresentano leffetto citopatico più eclatante di una infezione virale produttiva.

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10 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare w Laltro aspetto tipico di questa infezione è rappresentato dalla presenza di cellule definite DISCHERATOCITI orangiofile isolate o più spesso in gruppi, con nucleo picnotico ingrandito ed irregolare.

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12 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare w Donne NON gravide w Eseguire il prelievo per il pap-test prima di quello per il DNA w Rimuovere leccesso di muco dallorifizio cervicale o dallectocervice circostante usando un tampone in cotone o dracon. Eliminare il tampone. w Inserire la spazzolina nellorifizio cervicale ad una profondità di 1 - 1,5 cm fino a che i peli terminali più lunghi della spazzola toccano lectocervice, ruotarla compiendo 3 giri completi. w Introdurre la spazzola nel fondo della provetta da trasporto. Far scattare il perno nel punto segnato e tappare ermeticamente. w Prelevare il campione per il DNA prima di applicare acido acetico o iodio.

13 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare w Donne gravide w Eseguire il prelievo per il pap-test prima di quello per il DNA w Rimuovere il muco in eccesso dallorifizio esterno del collo dellutero, usando uno dei due tamponi dracon forniti. Eliminare il tampone. w Introdurre il tampone nel canale endocervicale e ruotarlo di 180° per 5 volte in direzione alternativamente opposta w Ritirare il tampone delicatamente, evitando il contatto con la mucosa vaginale. w Introdurre il tampone nel fondo della provetta da trasporto. Far scattare il perno nel punto segnato e tappare ermeticamente.

14 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare w TRASPORTO DEI CAMPIONI I campioni possono essere conservati fino a 2 settimane a temperatura ambiente

15 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare w Test: ibridazione in soluzione Hybrid Capture II (HC II) HPV basso rischio oncogeno: 6, 11, 42, 43, 44 HPV intermedio – alto rischio oncogeno: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68.

16 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare w La tecnologia adottata utilizza una micropiastra di ibridazione con segnale amplificato che utilizza la chemioluminiscenza per la rilevazione qualitativa. w La luce prodotta dalla reazione viene misurata mediante luminometro in unità di luce relativa (RLUs).

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18 Dal Microscopio alla Biologia Molecolare n. 341 donne con Pap-test anomalo: - n. 145 HPV-DNA - (43%) - n. 196 HPV-DNA + (57%) - n. 129 Alto Rischio (66%) - n. 50 Alto/Basso R. (25%) - n. 17 Basso Rischio ( 9%)

19 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare - Pap-test anomalo HPV-DNA+HPV-DNA- Ascus n.179 n. 84 (47%) n. 95 (53%) L-SIL n.150 n.104(70%) n. 46 (30%) H-SIL n. 12 n.12(100%) n. 0

20 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare n. 207 donne: n. 100 follow-up (48%) n. 61 casi clinici (30%) n. 46 citologia negativa (22%)

21 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare n. 207 donneHPV-DNA+HPV-DNA- Follow-up n.100 n. 26 (26%)n.74 (74%) Casi clinici n.61 n. 19 (31%)n. 42 (69%) Citologia neg. n. 46 n. 4 ( 9%)n. 42 (91%)

22 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare w Citologia su strato sottile w Luso di metodiche di allestimento di preparati citologici su strato sottile si sta diffondendo anche in Italia. w È importante verificare se questa nuova modalità di preparazione possa aumentare la sensibilità e specificità rispetto allallestimento tradizionale.

23 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare w Permette di ottenere preparati in strato sottile con un processo di filtrazione o sedimentazione w Riduce la percentuale di inadeguati rispetto al convenzionale w Migliora laccuratezza w Può essere successivamente utilizzata per metodiche molecolari ( HPV)

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30 Dal Microscopio alla Biologia Molecolare Prelievo convenzionale Oltre l80% del campione viene scartato Cellule oscurate da sangue, muco e detriti Qualità variabile

31 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare Prelievo in fase liquida Il 100% del campione raccolto viene trasferito nel flacone Il campione viene omogeneizzato e si randomizzano le cellule Riduzione al minimo di elementi oscuranti Vetrino chiaro, uniforme e riproducibile

32 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare Nei primi anni 90 si è affermato in Europa ed in Italia il primo sistema di lettura computer- assistita il cui principio di lettura, definito a reti neurali, si basava sulla selezione dal vetrino di una serie di immagini che erano presentate al lettore su uno schermo video. Tali immagini identificavano per ogni vetrino i campi più atipici che erano stati selezionati in base ad un confronto morfologico tra la memoria dello strumento ed i campioni esaminati.

33 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare Successivamente si è allestito uno strumento formato da un corpo centrale con obbiettivi e telecamere, per digitalizzare le immagini, che una serie di computer, e relativi software, analizzano con algoritmi.

34 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare Il sistema utilizza un microscopio ad alta velocità e un software che immagazzina e interpreta le immagini dello striscio in base a dei parametri (densità ottica, rapporto nucleo/citoplastico, ecc.) predeterminati. Ha lo scopo di individuare il carcinoma squamoso, ladenocarcinoma e tutte le lesioni precancerose.

35 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare w Recupero di falsi negativi nel controllo di qualità w Screening primario

36 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare w 1)Apertura di carico: tiene fino a 288 per 30 ore di lavoro w 2)Sensore di contatto: verifica la presenza del vetrino w 3)Lettore codice a barre: identifica il vetrino w 4)Videomicroscopio ad alta velocità: acquisisce rapidamente le immagini dal vetrino

37 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia SLIDE PROCESSOR 200 VETRINI IN 24 ORE

38 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Copy service application PREP or Conventional Slide Slide Processor SlideWizard Field Relocation and Review The AutoPap Primary Screening System

39 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Slide wizard field relocation and review Microscopio e computer. Rilettura dei Review. Mappatura di 15 campi più significativi.

40 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare No further review 25%

41 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare Review: 5 Ranks Classificazione basata sul grado di probabilità di anormalità citologiche

42 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare 5 (ranks) quintili w 1-2 le categorie con maggiore probabilità di anomalia w minore rischio di anomalia


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