Dal Microscopio alla Biologia Molecolare

Presentazione sul tema: "Dal Microscopio alla Biologia Molecolare"— Transcript della presentazione:

1 Dal Microscopio alla Biologia Molecolare
Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia Dal Microscopio alla Biologia Molecolare La Citologia Cervico-Vaginale: nuove tecnologie

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Human Papilloma Virus (HPV): - Papovavirus – Papilloma DNA circolare con 8000 paia di basi 2 capsidi proteici Replica virale (nucleo cell. epit. squamose) Trasmissione sessuale Virus epiteliotrofico Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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GENOMA VIRALE: regione regolatoria regione geni tardivi (L1, L2) regione geni precoci (E1, E2, E4, E5, E6, E7) E6 – p53 E7 – p103, p107 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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Regione REGOLATORIA regola la trascrizione dei geni controllando la produzione di proteine virali e particelle infettive Regione GENI TARDIVI con due unità trascrizionali, L1- L2 che codificano per le proteine del capside,rispettivamente per il capside maggiore e minore. Regione GENI PRECOCI con 6 unità trascrizionali dette E1,E2,E4,E5,E6,E7,che codificano per le proteine necessarie alla replica virale. Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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Sequenze di particolare interesse sono presenti nella regione precoce E6 - E7 di alcuni genotipi oncogeni. Infatti queste sequenze codificano proteine in grado di interferire con l’attività di proteine espresse da geni cellulari oncosoppressori e questo può portare ad una proliferazione cellulare incontrollata e quindi può contribuire ad innescare la progressione neoplastica Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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In uno striscio cervico vaginale, l’aspetto morfologico specifico e patognomonico della presenza di HPV, si basa sulla presenza di cellule, definite COILOCITI, che rappresentano l’effetto citopatico più eclatante di una infezione virale produttiva. Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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L’altro aspetto tipico di questa infezione è rappresentato dalla presenza di cellule definite DISCHERATOCITI orangiofile isolate o più spesso in gruppi, con nucleo picnotico ingrandito ed irregolare. Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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Donne NON gravide Eseguire il prelievo per il pap-test prima di quello per il DNA Rimuovere l’eccesso di muco dall’orifizio cervicale o dall’ectocervice circostante usando un tampone in cotone o dracon. Eliminare il tampone. Inserire la spazzolina nell’orifizio cervicale ad una profondità di 1 - 1,5 cm fino a che i peli terminali più lunghi della spazzola toccano l’ectocervice, ruotarla compiendo 3 giri completi. Introdurre la spazzola nel fondo della provetta da trasporto. Far scattare il perno nel punto segnato e tappare ermeticamente. Prelevare il campione per il DNA prima di applicare acido acetico o iodio. Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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Donne gravide  Eseguire il prelievo per il pap-test prima di quello per il DNA Rimuovere il muco in eccesso dall’orifizio esterno del collo dell’utero, usando uno dei due tamponi dracon forniti. Eliminare il tampone. Introdurre il tampone nel canale endocervicale e ruotarlo di 180° per 5 volte in direzione alternativamente opposta Ritirare il tampone delicatamente, evitando il contatto con la mucosa vaginale. Introdurre il tampone nel fondo della provetta da trasporto. Far scattare il perno nel punto segnato e tappare ermeticamente. Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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TRASPORTO DEI CAMPIONI I campioni possono essere conservati fino a 2 settimane a temperatura ambiente Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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Test: ibridazione in soluzione Hybrid Capture II (HC II) HPV basso rischio oncogeno: 6, 11, 42, 43, 44 HPV intermedio – alto rischio oncogeno: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68. Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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La tecnologia adottata utilizza una micropiastra di ibridazione con segnale amplificato che utilizza la chemioluminiscenza per la rilevazione qualitativa. La luce prodotta dalla reazione viene misurata mediante luminometro in unità di luce relativa (RLUs). Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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n. 341 donne con Pap-test anomalo: - n HPV-DNA - (43%) - n HPV-DNA + (57%) n Alto Rischio (66%) n Alto/Basso R. (25%) n Basso Rischio ( 9%) Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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Pap-test anomalo HPV-DNA+ HPV-DNA- Ascus n.179 n. 84 (47%) n. 95 (53%) L-SIL n.150 n.104(70%) n. 46 (30%) H-SIL n. 12 n.12(100%) n. 0 Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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n. 207 donne: n. 100 follow-up (48%) n casi clinici (30%) n citologia negativa (22%) Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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n. 207 donne HPV-DNA+ HPV-DNA- Follow-up n.100 n. 26 (26%) n.74 (74%) Casi clinici n.61 n. 19 (31%) n. 42 (69%) Citologia neg. n. 46 n. 4 ( 9%) n. 42 (91%) Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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Citologia su strato sottile L’uso di metodiche di allestimento di preparati citologici su strato sottile si sta diffondendo anche in Italia. È importante verificare se questa nuova modalità di preparazione possa aumentare la sensibilità e specificità rispetto all’allestimento tradizionale. Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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Permette di ottenere preparati in strato sottile con un processo di filtrazione o sedimentazione Riduce la percentuale di inadeguati rispetto al convenzionale Migliora l’accuratezza Può essere successivamente utilizzata per metodiche molecolari ( HPV) Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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Prelievo convenzionale Oltre l’80% del campione viene scartato Cellule oscurate da sangue, muco e detriti Qualità variabile Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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Prelievo in fase liquida Il 100% del campione raccolto viene trasferito nel flacone Il campione viene omogeneizzato e si randomizzano le cellule Riduzione al minimo di elementi oscuranti Vetrino chiaro, uniforme e riproducibile Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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Nei primi anni 90 si è affermato in Europa ed in Italia il primo sistema di lettura computer-assistita il cui principio di lettura, definito a “reti neurali”, si basava sulla selezione dal vetrino di una serie di immagini che erano presentate al lettore su uno schermo video. Tali immagini identificavano per ogni vetrino i campi più “atipici” che erano stati selezionati in base ad un confronto morfologico tra la memoria dello strumento ed i campioni esaminati. Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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Successivamente si è allestito uno strumento formato da un corpo centrale con obbiettivi e telecamere, per digitalizzare le immagini, che una serie di computer, e relativi software, analizzano con algoritmi. Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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Il sistema utilizza un microscopio ad alta velocità e un software che immagazzina e interpreta le immagini dello striscio in base a dei parametri (densità ottica, rapporto nucleo/citoplastico, ecc.) predeterminati. Ha lo scopo di individuare il carcinoma squamoso, l’adenocarcinoma e tutte le lesioni precancerose. Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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Recupero di falsi negativi nel controllo di qualità Screening primario Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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1)Apertura di carico: tiene fino a 288 per 30 ore di lavoro 2)Sensore di contatto: verifica la presenza del vetrino 3)Lettore codice a barre: identifica il vetrino 4)Videomicroscopio ad alta velocità: acquisisce rapidamente le immagini dal vetrino Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

36 SLIDE PROCESSOR 200 VETRINI IN 24 ORE
Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

37 The AutoPap Primary Screening System
Copy service application PREP or Conventional Slide Slide Processor SlideWizard Field Relocation and Review The AutoPap Primary Screening System Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

38 Slide wizard field relocation and review
Microscopio e computer. Rilettura dei Review Mappatura di 15 campi più significativi. Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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No further review 25% Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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Review: 5 Ranks Classificazione basata sul grado di probabilità di anormalità citologiche Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia

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5 (ranks) quintili 1-2 le categorie con maggiore probabilità di anomalia 3-4-5 minore rischio di anomalia Dott. Basilio Passamonti-Az. USL n.2 dell'Umbria-Centro di Citologia-Perugia