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MECCANISMI DI SILENZIAMENTO GENICO. Sistema del Mating Type di lievito dove inizialmente è stato scoperto il fenomeno del Silenziamento Le cassette HML.

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1 MECCANISMI DI SILENZIAMENTO GENICO

2 Sistema del Mating Type di lievito dove inizialmente è stato scoperto il fenomeno del Silenziamento Le cassette HML ed HMRa pur contenendo le informazioni complete per il tipo coniugativo vengono mantenute silenziate e normalmente non si esprimono durante la vita della cellula. Esse sono necessarie solamente come donatori di informazione durante lo Switching da un tipo allaltro. SILENZIAMENTO GENICO IN LIEVITO

3 COME VENGONO MANTENUTI SILENZIATI I GENI HM? HMRa a1a2 xz1 A EB EI ARSRAP1ABF1 HMR-E 260bp 85bp wt A E B A E A B E B rap1 - abf1 - rap1 - abf1 - ssa (ars - ) ssb (abf1 - ) sil. sint. + +/ / Allele HMR-E Repressione Vale sia come delezioni che come mutazioni puntiformi FUNZIONI RIDONDANTI

4 SILENCER E così definito per analogia con gli elementi Enhancer: Può funzionare a distanze variabili dal suo gene bersaglio La sua attività è indipendente dallorientamento della sequenza Delezioni di HMR-E : TOTALE DEREPRESSIONE Delezioni di HMR-I : MINORE DEREPRESSIONE Delezioni di HML-E ed HML-I : singolarmente non hanno forti effetti ma INSIEME danno TOTALE DEREPRESSIONE La sostituzione dellintera regione codificante di HM con altri geni, sia della RNA PolII (URA, LEU), sia della RNA PolIII (tRNA), comporta la completa REPRESSIONE dei geni sostituiti.

5 PROTEINE RESPONSABILI DEL SILENZIAMENTO GENICO IN LIEVITO Rap 1* Istoni H3 ed H4 Sir 1**/ORC Sir 2/3/4** Delezioni in questi fattori, da sole o in combinazione dereprimono i loci silenti in maniera parziale o, più frequentemente, totale. Mutazioni negli istoni che dereprimono i loci HM sono sia delezioni delle code N-Terminali, sia mutazioni puntiformi nelle Lisine presenti nelle code. Questo implica anche un coinvolgimento dellacetilazione in questi residui. *Rap 1 = Repressor Activator Protein **Sir1/2/3/4 = Silent Information Regulator

6 SIR3 REGIONE SILENZIATRICE REGIONE SILENZIATRICE LOCUS SILENTE HM Prova genetica dellinterazione tra SIR3 e H4 Delezione degli aa della coda N-terminale induce derepressione dei loci silenti e fa diminuire la capacità coniugativa del lievito. Sono state trovate mutazioni in SIR3 che compensano questa situazione. Ciò indica che esiste una interazione fisica tra la proteina Sir3 e listone H4. La mutazione compensativa ripristina linterazione e quindi il silenziamento. Genetic evidence for an interaction between SIR3 and histone H4 in the repression of the silent mating loci in Saccharomyces cerevisiae. L.M. Johnson, P.S. Kayne, E.S. and M. Grunstein Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990), Vol. 87,

7 SILENZIAMENTO TELOMERICO

8 In lievito le regioni subtelomeriche sono ricche in sequenze medio-lunghe ripetute un numero variabile di volte a seconda del ceppo. Gli elementi X si trovano in tutti i telomeri si S. cerevisiae Gli elementi Y possono essere presenti in numero da 0 a 4. Questi elementi si muovono per ricombinazione e contribuiscono alla conservazione delle estremità.

9 IL SILENZIAMENTO GENICO AVVIENE ANCHE IN PROSSIMITA DELLE REGIONI TELOMERICHE URA 3 TEL Trascrizione di URA3 +/ Sir3++ = Completa Repressione sir3 = Forte Derepressione Mutanti nei geni Sir 2/3/4 Rap1 Istoni (code N-Terminali) portano a derepressione dei geni posti in posizione subtelomerica. Overespressione di Sir3 espande il silenziamento fino a molte Kb dallestremità: Effetto a distanza mediato dalla cromatina Sir3 (wt) Silenziamento Veriegato Metastabile

10 MATgeneTELEIHMR Sir2, Sir3, Sir4 Istoni H3, H4 Rap1 C TrascrizioneRepressione Sir1 ORC Fattori comuni nel silenziamento dei loci HM e dei Telomeri Sir1 è fondamentale per stabilire il silenziamento in HM ma non serve per il suo mantenimento. Sir1 non partecipa al silenziamento telomerico. ORC = Origin Recognition Complex Agisce sulla sequenza ARS (origine di replicazione) E un complesso multiproteico in cui alcune subunità interagiscono con Sir1 Mutazioni in ORC inducono derepressione di HM Esperimenti con mutanti condizionali che dereprimono HM necessitano di almeno un passaggio in fase S per restaurare la repressione.

11 Il ruolo degli istoni H3 ed H4 è fondamentale per il mantenimento del silencing sia dei loci HM sia ai Telomeri. Mutazioni che influiscono sul silenziamento sono: Delezioni delle code N-Terminali Mutazioni puntiformi nelle Lisine acetilabili presenti nelle code. Recentemente è stato scoperto anche un coinvolgimento di residui amminoacidici che possono essere metilati sullN-terminale degli istoni. Il Silenziamento è quindi un fenomeno prettamente EPIGENETICO

12 Il silenziamento avviene a causa della formazione di una struttura fortemente eterocromatizzata che si organizza secondo schemi precisi sulla base di interazioni tra tutti i componenti coinvolti. Tecniche genetiche (uso di mutanti, sistema dei due ibridi) e biochimiche (immunofluorescenza, uso di anticorpi, ChIP) hanno permesso nel tempo di definire quali sono queste interazioni. Rap1 lega direttamente il DNA Rap1 interagisce con le proteine SIR Le proteine SIR formano un complesso Sir2/3/4 Le proteine SIR interagiscono con le code N-Terminali degli istoni H3 ed H4 Sui loci silenti HM la proteina Sir1 interagisce con componenti del complesso ORC

13 Modelli proposti per leterocromatizzazione dei loci HM e dei Telomeri Eterocromatina in lievito: Non visibile al microscopio Resistente alle nucleasi Replicazione tardiva Ipoacetilazione generalizzata

14 HM Silenziamento obbligatorio. Funzioni ridondanti. E una forma di regolazione genica. TELOMERI Silenziamento non obbligatorio ma VARIEGATO e METASTABILE Funzione del silenziamento telomerico non chiarita, Ha un valore funzionale o È solamente una conseguenza?

15 In lievito le regioni subtelomeriche sono ricche in sequenze medio-lunghe ripetute un numero variabile di volte a seconda del ceppo. Gli elementi X si trovano in tutti i telomeri si S. cerevisiae Gli elementi Y possono essere presenti in numero da 0 a 4. Questi elementi si muovono per ricombinazione e contribuiscono alla conservazione delle estremità. In lievito mutanti est1 - sono letali a causa dellestremo accorciamento dei telomeri, ma possono essere recuperati tramite multiple inserzioni di elementi Y.

16 SILENZIAMENTO IN CONTESTI NATURALI Geni inseriti in diversi telomeri di lievito sono variamente soggetti a silencing Alcune sequenze presenti negli elementi Y ed STR di X hanno attività STAR: SubTelomeric Anti-silencing Region La sequenza core X e un particolare tratto di Y facilitano il silencing e sono quindi chiamate Sub-Telomeric Silencing Elements Nel complesso: La cromatina sub-telomerica su cromosomi naturali è una regione di repressione trascrizionale inframmezzata da sottodomini che permettono la trascrizione

17 Il silenziamento interessa anche altri organismi: 1) Schizosaccharomyces pombe Effetti di posizione sono stati inizialmente scoperti in Drosophila dove il silenziamento interessava geni traslocati in prossimità delleterocromatina centromerica. Anche in S. pombe i loci per il mating type sono silenti, con modalità simili a quelle di S. cerevisiae. In questo caso il silenziamento dipende dai fattori Clr1-4, Clr6, Swi6, Rik1 In S. pombe è stato ben caratterizzato anche il fenomeno del silenziamento centromerico (analogo a quello della Drosophila). Gli stessi fattori che sono responsabili del silencing sui loci del mating type, sono coinvolti anche in questi due casi. Taz1, presente sui telomeri, è omologa di Rap1 di S. cerevisiae. Clr4: omologo di Su(var)3-9 – Metilasi Clr3: omologo di Rpd3 – Deacetilasi istonica Clr6: omologo di Hda1 – Deacetilasi istonica Swi6: omologo di HP1 Rik1 e Chp1: proteine a cromodominio – favoriscono la met di K9 da parte di Clr4 e la localizzazione centromerica di Swi6

18 Alcuni precedenti lavori avevano ottenuto evidenze contro lesistenza di TPE in cellule umane. Questo lavoro pone le basi per una riconsiderazione della sua esistenza, e per la ricerca di caratteristiche comuni e differenze con il TPE descritto ampiamente in lievito. 2) Cellule umane

19 Uso di un plasmide lineare contentente: Luciferasi + sequenze telomeriche umane Integrazione del plasmide in cellule HeLa in cui sia attiva la Telomerasi Rottura del cromosoma nel punto di integrazione ed estensione delle sequenze telomeriche Selezione dei cloni in cui si verificano questi eventi Risultato : inserzione di un gene reporter in posizione subtelomerica. DISEGNO SPERIMENTALE

20 1) Il gene Luciferasi presente in posizione subtelomerica viene espresso circa 10 volte meno che lo stesso gene integrato in loci interni al cromosoma. 2) Lespressione del gene torna ad aumentare in seguito al trattamento con Tricostatina A, un inibitore delle deacetilasi (ricordare che leterocromatina solitamente è fortemente ipoacetilata). 3) Lespressione della luciferasi diminuisce ulteriormente aumentando lattività della Telomerasi, cioè inducendo ulteriore allungamento delle sequenze telomeriche.

21 REGIONI SUBTELOMERICHE UMANE ~ Kb contenenti blocchi di sequenze ripetute composite. Generati da eventi di copiatura e trasferimento di sequenze tra cromosomi. Questo genera un pattern di omologia complesso ed estensivo tra cromosomi. Es.: subtelomero 3q è correlato con almeno altre 35 estremità. MECCANISMI RESPONSABILI: Ricombinazione Traslocazione Conversione genica (sostituzione totale o parziale di una regione subtelomerica con unaltra) Duplicazione per eventi di trasposizione. Si tratta di eventi recenti – si identificano differenze individuali Es: trovate due sequenze presenti su 22 cromosomi – Lanalisi in individui diversi ha mostrato una diversa distribuzione. Si può seguire levoluzione di molti di questi blocchi. Es: blocco f7501 = su un solo cromosoma nei primati, stabilmente su 3 cromosomi nelluomo (3q, 15q, 19q). Variabilmente su altri 11. Si è evoluto quindi in breve tempo.

22 Le regioni subtelomeriche possono contenere geni La densità genica è comunque bassa. Nei telomeri umani anche le sequenza telomeriche contengono nucleosomi ma la loro spaziatura è diversa da quella della normale cromatina. Questi nucleosomi sono caratterizzati da metilazione come la cromatina pericentrica: contengono H3K9me3 e H4K20me3 Sono arricchiti in Hp1 Hanno bassi livelli di acetilazione sugli istoni H3 ed H4 Le regioni subtelomeriche sono anche metilate sul DNA. Non risultano fortemente metilate le sequenze telomeriche stesse.

23 I primi esperimenti di F. Palladino e S. Gasser nel 1993 dimostrano, tramite immunofluorescenza, che le proteine Rap1 e Sir3 (uso di anticorpi anti-Rap1 e anti-Sir3) si localizzano in regioni discrete alla periferia nucleare. Verosimilmente si tratta di foci in cui si raggruppano estremità telomeriche di vari cromosomi. Questi dati hanno posto le basi per la formulazione di unipotesi di esistenza di TERRITORI NUCLEARI funzionalmente significativi. Questa ipotesi si è rivelata importante per la repressione trascrizionale.

24 Un gene reporter fiancheggiato da due silenziatori di HM e posto a varie distanze dal telomero mostra una diminuzione progressiva della repressione genica con laumentare della distanza da esso. Le regioni telomeriche, i loci silenti HM e le proteine SIR co-localizzano tutti in questi foci perinucleari. Il modello proposto prevede che regioni telomeriche non silenti si localizzino alla periferia nucleare tramite yKu. Una volta localizzato il telomero in questa regione ricca in proteine SIR, esso può andare incontro a repressione. Il silencing si rafforza ulteriormente grazie allattività di ancoraggio di Sir4 che interagisce con Esc1, proteina di membrana. Questo riflette probabilmente la rilevanza del pool delle proteine SIR, che nei foci perinucleari sono molto concentrate e si diluiscono man mano che ci si allontana da queste regioni. Le proteine SIR sono comunque presenti in quantità limitante nel nucleo.

25 Fattori responsabili della formazione dei territori telomerici perinucleari Ci sono evidenze per due possibili modelli di formazione di territori nucleari. B) Questo meccanismo prevede lancoraggio alla membrana nucleare tramite il coinvolgimento di Mlp1/2, che sono yKu-binding proteins. Il complesso si formerebbe al livello dei pori nucleari in quanto mutazioni nelle proteine del poro, Nup60 e Nup145, disgregano i foci (mostrano dispersione di essi) e dereprimono geni reporter. Questo sembra valido per geni ancorati artificialmente. A)yKu sarebbe la principale responsabile dellancoraggio della cromatina silente alla membrana, in una maniera indipendente dalla presenza delle proteine del poro nucleare. Questo avviene su regioni naturali, telomeri e loci HM. Recentemente si hanno evidenze che i telomeri alla periferia nucleare sono altamente mobili. Il modello che ne deriva è quello in cui linterazione tra cromatina ed involucro nucleare sia altamente dinamico e adattabile a cambiamenti metabolici come i passaggi di fase nel ciclo cellulare.

26 Le proteine Ikaros sono richieste per il normale sviluppo di cellule T, B ed NK. Attivano lespressione di geni linfocita-specifici: 5, Vpre-B, Lck, CD8, IL-2R, TCR e TCR ed altri. Si conoscono due isoforme di Ikaros (1 e 2), le più abbondanti nei linfociti B e T maturi. Ikaros è un fattore che lega il DNA. Ikaros e LETEROCROMATINA

27 Tramite la tecnica dellimmuno-FISH (fluorescent in situ hybridization), usando anticorpi contro il dominio C-terminale di Ikaros si evidenzia una distribuzione in regioni discrete a ridosso della periferia nucleare. Questo è evidente in nuclei di cellule pre-B (b e c) e in normali linfociti B isolati dalla milza (d). Anticorpi contro un fattore non correlato Elf1 (e) non mostrano mai una simile distribuzione.

28 Ikaros si localizza sulleterocromatina centromerica nei nuclei di cellule B: colocalizzazione di Ikaros, HP1 e sequenze -satellite Colocalizzazione di Ikaros (verde) ed M31 (rosso). M31 non è altri che HP1 (Heterochromatin Protein 1) umana ed è molto abbondante nelleterocromatina centromerica. Ibridazione in situ con una sonda per il -satellite del centromero. Il segnale (giallo) si localizza sulle regioni centromeriche. Ikaros -satellite In tre differenti sezioni analizzate Ikaros e il -satellite mostrano una localizzazione comune

29 5 CD2 B3 Bal-17 Geni dipendenti da Ikaros e trascrizionalmente inattivi si localizzano sui foci centromerici di Ikaros In cellule immature B3 alcuni geni regolati da Ikaros (es. CD2) sono inattivi trascrizionalmente e risultano localizzati negli stessi foci pericentromerici in cui si può rilevare la presenza di Ikaros. In cellule Bal-17, cellule B mature questi geni risultano attivi trascrizionalmente e mostrano anche una localizzazione più diffusa allinterno del nucleo. I geni regolati da Ikaros sono per lo più coinvolti nel differenziamento dei linfociti B Per altri geni, ad es. 5, vale il contrario. Ikaros = rosso Singolo gene = verde Colocalizzazione = giallo

30 I geni regolati da Ikaros si trovano su cromosomi diversi e in differenti posizioni rispetto ai centromeri, per cui si può escludere un effetto di posizione classico. E più probabile che questi domini genetici vengano sequestrati in maniera reversibile in localizzazione pericentromerica e che vengano silenziati in trans. Ikaros media il silenziamento facoltativo di geni tipo cellulare-specifici attuando la loro giustapposizione con leterocromatina pericentromerica.


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