Analisi Raman di ovociti bovini sottoposti a vetrificazione UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI “FEDERICO II” Giulia Rusciano

Raman Scattering Scattering inelastico di radiazione A Raman fu assegnato il Premio Nobel inNobel Fisica nel 1930 EvEv E0E0 Energy E”E” Stokes Radiation λ0λ0 λ0λ0 λ 0 + λ v λ0λ0 Raileight diffusion Anti-Stokes radiation λ0λ0 λ 0 - λ v Virtual level Ground state

λ0λ0 λ0λ0 λ 0 ± λ v Raman scattering cartoon: Inf ormazioni su composizione molecolare, ambiente chimico, struttura cristallina, legami e fase del campione preso in esame. Ogni spettro è un’impronta dei legami chimici presenti nel campione

variazione nella polarizzabilità molecolare  Vibrazioni molecolari “Raman - attive” in cui    sen(2  vib t 

Raman vs IR Raman active mode Raman inactive mode IR active mode IR inactive mode I modi attrivi nell’infrarosso sono generalmente poco Raman attivi I modi attrivi nell’infrarosso sono generalmente poco Raman attivi L’acqua è poco Raman attiva L’acqua è poco Raman attiva

Experimental Set-up AFM+Raman system: Witec alpha 300 Inverted configuration Laser 532 nm

7 Spettro Raman in una molecola Semplice Modi normali di vibrazione = 3N-6 ( molecola 3D ). Ad ogni modo Raman-attivo è associato un picco nello spettro C 6 H 6

Il Raman nel biologico Campioni BIO = proteine, lipidi, DNA etc.

Basis component analysis BC 1 BC 2 BC 3 SiSi cm -1 Intensity SiSi Componente 1Componente 2Componente 3

Principal Components Analysis (PCA) PC 1 PC 2 PC 3 S1S1 cm -1 Intensity S1S1 Data matrix [n×p] with Not-diagonal covariance matrix (correlated variables) Data matrix [n×p] with Not-diagonal covariance matrix (correlated variables) New data matrix [n×k], k<<p with diagonal covariance matrix (uncorrelated variables) New data matrix [n×k], k<<p with diagonal covariance matrix (uncorrelated variables) I i ( ) = PC i {i = 1, 2, 3,…} Decomposition in basis functions that are “more statistically significant” spectra determined by maximizing the statistical variance

Ovocita La cellula uovo è di forma sferica ed ha un diametro di 100 µm; possiede una grande quantità di citoplasma, ricco di ribosomi e sostanze nutritive, come lipidi e proteine. La membrana della cellula uovo è rivestita da una zona pellucida: protegge l'uovo da danni meccanici e forma una barriera per l’ingresso dello spermatozoo.

Vetrificazione La vetrificazione è il processo durante il quale un liquido si trasforma in solido amorfo. Avviene in seguito ad un brusco raffreddamento del materiale biologico. Se invece il raffreddamento viene svolto lentamente si può avere la formazione di una struttura molecolare ordinata. La vetrificazione è largamente utilizzata per la conservazione di ovocellule umane

Fecondazione assistita “scongelamento” attesa fecondazione

Cosa faremo: Sudio della riorganizzazione della zona pellucida, del citoplasma e della membrana in funzione del tempo di attesa.