Corso di Biochimica clinica Il laboratorio nella valutazione della funzionalità del fegato Prof. Giuseppe Castaldo, anno accademico 2015-16

Il fegato Il fegato è l'organo metabolicamente più complesso

Cellule del Fegato cellule parenchimali (65% volume del fegato): epatociti cellule non parenchimali (35% volume del fegato): cellule endoteliali cellule del sistema reticolo-endoteliale (di Kupffer) cellule stellate o cellule di Ito cellule dei dotti biliari

La vena porta Il fegato riceve un duplice apporto di sangue attraverso la vena porta e l'arteria epatica La vena porta convoglia al fegato il sangue venoso proveniente dall'intestino e dalla milza 1500 ml/min (75% dell’apporto ematico totale)

Il lobulo epatico: unità morfofunzionale

Vena epatica Proteine, es. albumina e protrombina Amminoacidi Glucosio Lipidi Urea Dotto biliare Bilirubina Sali biliari Glucuronidi Vena porta Nutrienti e tossine Piccolo intestino Circolazione enteroepatica sinusoide canalicolo Ossidazione Glicolisi, Sintesi Detossificazione

Principali funzioni del fegato Metabolismo dei Carboidrati Metabolismo dei Lipidi Metabolismo delle Proteine Sintesi delle Plasmaproteine Sintesi dei Fattori della coagulazione Trasformazione dello ione Ammonio Funzioni di coniugazione e detossificazione Funzioni di deposito

Specifiche malattie tendono a interessare le diverse componenti epatiche con quadri clinici prevedibili spesso con conseguenze cliniche e biochimiche caratteristiche l'epatite acuta si manifesta principalmente con un danno epatocellulare la cirrosi con una graduale alterazione della funzione protidosintetica Virale (A, B, C, …) Alcoolica Da farmaci Epatite acuta Epatite cronica Cirrosi Epatocarcinoma

I sintomi di una malattia epatica acuta riflettono in genere la necrosi epatocellulare Se le cause della malattia epatica regrediscono il fegato si rigenera Il mito del titano Prometeo rappresentato in un quadro fiammingo del '600

il tessuto connettivo si accresce, Cirrosi epatica il tessuto connettivo si accresce, l’architettura dei lobuli epatici diventa sempre più disorganizzata, compromettendo le funzioni epatiche i lobuli epatici "strangolati” dal tessuto connettivo

Marcatori biochimici per lo studio del fegato Coniugazione Bilirubina Citolisi Alanina Amminotrasferasi (ALT, GPT) Aspartato Amminotrasferasi (AST, GOT) Lattato Deidrogenasi (LDH) Colestasi Fosfatasi Alcalina (AP) g-Glutamiltrasferasi (g-GT) Protidosintesi Albumina e altre sieroproteine Pseudocolinesterasi Tempo di Quick

Metabolismo della bilirubina Distruzione di eritrociti senescenti Sistema Reticolo Endoteliale Distruzione di eritrociti in maturazione Midollo Osseo 80-85% 15-20% emoglobina Turnover dell’eme e dei suoi prodotti Fegato eme globina biliverdina Eme ossigenasi bilirubina Biliverdina riduttasi

(idrosolubile  escreta con la bile) bilirubina Glucuroniltransferasi *Legata all’albumina coniugata (idrosolubile  escreta con la bile) non coniugata (liposolubile) Circolo enteroepatico dei bilinogeni azione batterica nell’intestino bilinogeni stercobilinogeni urobilinogeni * È insolubile in acqua ed è trasportata nel plasma, in massima parte legata all’albumina

patologo e clinico olandese Hijmans van den Bergh patologo e clinico olandese (1869-1943)

Bilirubinemia totale e frazionata Bilirubina totale (Reazione di van den Bergh) Bilirubina totale Valori di riferimento: 0,4-1 mg/dl coniugata 0-0,4 mg/dl legata all’albumina 0,4-1 mg/dl Bilirubina diretta Bilirubina indiretta Reazione diretta di van den Bergh Sali di diazonio + bilirubina  composti azoici colorati Reazione indiretta di van den Bergh Solvente organico  Sali di diazonio + bilirubina composti azoici colorati

Congenital icterus Pre-hepatic: Gilbert Hepatic: Crjgler Najjar, Rotor Post-hepatic: Dubin Johnson

Gilbert Enhanced unconjugated bilirubin (values between 1,5 and 6 mg/dL, usually < 3 mg/dL) 8% of adult population, benign Altered liver uptake and conjugation of bilirubin Frequent alterations of drugs metabolism (i.e., paracetamol) It appears between 20 and 30 years and thus, frequently disappear Normal levels of cytolytic and cholestetic enzymes Autosomal recessive Reduced activity of bilirubin-uridin-glucuronosil transferase (UGT-1) UGT-1A1 gene (mutation within the TATA box, TA repeat)

Gilbert: Two copies of the (TA) 7 repeat wt mut G A T C G A T C 1 2 3 4 5 6 7 8 (TA)7 (TA)6

Dubin-Johnson Total bilirubin: 2 - 5 mg/dL; conjugated bilirubin: 60-70 % It appears during the II- III rd decade Triggered by pregnancy, surgery and estrogenic therapy Good prognosis Autosomal recessive Altered excretion of conjugated bilirubin in the bile canaliculus Altered MRP2 (multidrug resistence-associated protein 2)

Crigler-Najjar rare and severe neonatal onset neurological complications Phototherapy Eye protection

type I type II complete deficiency of the UDP glucuronyl transferase bilirubin levels < 20 mg/dL no conjugated bilirubin in the bile type II partial deficiency of the enzyme phenobarbital helps to reduce bilirubin

Enzimi sierici come indicatori di danno epatocellulare e colestasi Indicatori di danno/necrosi epatocellulare Aminotrasferasi Lattico deidrogenasi e isoenzimi Indicatori di colestasi Fosfatasi alcalina Gamma-glutamiltranspeptidasi

Aminotrasferasi Aspartato aminotrasferasi (AST) Valori di riferimento Sono enzimi che appartengono alla classe delle trasferasi Aspartato aminotrasferasi (AST) Valori di riferimento Maschi: 10-45 UI/l Femmine: 5-30 UI/l Alanina aminotrasferasi (ALT) Valori di riferimento Maschi: 10-40 UI/l Femmine: 5-35 UI/l

Localizzazione dei principali enzimi epatici ALT AST

Perché le transaminasi sono localizzate principalmente nel fegato e nei muscoli?

AST Citoplasma Mitocondri ALT Citoplasma

5 isoforme 3 5 1 2 4 Lattico deidrogenasi Valori di riferimento: 340-450 UI/l Catalizza la conversione del lattato in piruvato Enzima tetramerico formato dall’associazione di quattro subunità di due diversi tipi: H (heart) e M (muscle) 5 isoforme 3 5 1 2 4

Espressione delle isoforme della Lattico deidrogenasi 1 2 3 1 2 1 2 1 2 4 5 1 2 3 4 4 5 4 5

Perché la Lattico deidrogenasi catalizza la reazione in due direzioni diverse nel fegato e nel muscolo?

Marcatori di Citolisi (AST, ALT, LDH) ↑ ↑ ↑ Epatite virale acuta ↑ ↑ ↑ Epatite acuta alcool ↑ ↑ Epatite cronica autoimmunitaria ↑ ↑ Epatite cronica attiva ↑ Insufficienza cardiaca dx ↑ Colestasi Falsi positivi Infarto Citolisi muscolare

Bambino (1-10 anni): 110-550 UI/l Fosfatasi alcalina Valori di riferimento Adulto: 50-190 UI/l Lattante: 110-700 UI/l Bambino (1-10 anni): 110-550 UI/l Adolescente: 130-700 UI/l È un enzima che appartiene alla classe delle idrolasi Le fosfatasi alcaline sono prodotte da geni diversi e classificate in: FA tessuto-specifica: isoenzima principale, correlato al metabolismo osseo e alle lesioni epato-biliari FA intestinale: non è un marcatore specifico in molte malattie epatiche si ha un incremento sierico di questo isoenzima; è metabolizzata più velocente degli altri due isoenzimi e per questo ha una bassa concentrazione sierica FA placentare e simil-placentare: in gravidanza, prodotte dalla placenta

Espressione delle isoforme della fosfatasi alcalina

Un aumento del valore necessita perciò sempre di un'indagine più approfondita e di un'attenta comparazione con altri valori di laboratorio

Gamma-glutamiltranspeptidasi sierica Valori di riferimento Uomo: 6-28 UI/l Donna: 4-18 UI/l Neonato: 10-100 UI/l Catalizza il trasferimento di un gruppo glutammico tra peptidi e aminoacidi Aumenta nelle epatopatie con stasi biliare È un enzima di induzione (farmaci, etanolo)

Localizzazione della g-GT

Effetto dell’età e del sesso sui valori massimi di riferimento per AP e g-GT Fosfatasi alcalina g-Glutamil Trasferasi Maschi  Femmine

Marcatori di Colestasi (AP e g-GT) Colelitiasi Tumori epatici Neoplasie biliari Tumori della testa del pancreas Cirrosi biliare Falsi positivi g-GT Alcoolismo Epatite cronica Cirrosi Falsi positivi AP Gravidanza Malattie ossee Tumori ovarici

Marcatori biochimici di assunzione di etanolo Aumento della GGT (ma non di AP), anche dopo un singolo “carico” Aumento di MCV (volume corpuscolare medio) a causa del ridotto assorbimento di folati indotto dall’etanolo Aumento della trasferrina non glicosilata

Biochemical markers of liver fibrosis Fibro scan: GGT, ALT, Bilirubin, aptoglobin, apolipoprotein AI, alpha2-macroglobulin

Congenital liver diseases Hemochromatosis Alpha1 antitrypsin deficiency Cystic fibrosis Wilson’s disease

Serum alpha1 antitrypsin (nephelometric) Genetic analysis ?

Ridotta cupremia Ridotta ceruloplasmina

Pre-epatico Epatico Post-epatico S Bil totale S Bil coniugata S Bil non coniugata S AST A AP U Urobilinogeno U Bilirubina Feci

Come possiamo discriminare tra Gilbert ed ittero emolitico ?