Farmacogenetica e Farmacogenomica Definizione dei termini: Genetica: studio dei singoli geni di un organismo e delle caratteristiche individuali ereditabili legate ad essi Farmacogenetica Genomica: determinazione e studio dell’intera sequenza del DNA di un organismo, identificazione e studio del livello di espressione dei geni per comprenderne le interazioni e l’influenza sui meccanismi biologici e fisiologici in situazioni normali e patologiche Farmacogenomica Molto spesso i termini Farmacogenetica e Farmacogenomica vengono utilizzati come sinonimi

Farmacogenetica e Farmacogenomica Definizione dei termini: Farmacogenetica: studio delle differenze ereditarie nella risposta ad un farmaco, dovute a polimorfismi di particolari geni studio del rapporto tra mutazioni nella sequenza del DNA e differente efficacia e sicurezza di un farmaco Farmacogenomica: applicazione delle tecniche usate nella genomica per la determinazione e lo studio di più geni associati a malattie e alla risposta ai farmaci per individuare sia nuovi geni bersaglio per nuove terapie, sia profili genetici che influenzano l’effetto dei farmaci disegno di studi clinici che prevedano un arruolamento genotipo-specifico (genostratificazione) creazione, sviluppo e validazione di test diagnostici per la genotipizzazione dei pazienti

Variabilità della risposta ai farmaci Nonostante i farmaci vengano prescritti come validi per ogni paziente affetto dalle condizioni cliniche verso cui i farmaci hanno mostrato sperimentalmente di essere efficaci, c’è una notevole variabilità di risposta alle molecole che vengono somministrate. Tale variabilità si può manifestare in termini di mancata o solo parziale efficacia, oppure con la comparsa di più o meno gravi effetti collaterali, per cui, mentre un determinato principio attivo può essere benefico e innocuo per alcuni soggetti, per altri può rivelarsi non solo inutile ma addirittura letale. Nel corso del 1994, negli Stati Uniti, quasi due milioni di pazienti sono stati ospedalizzati a causa di reazioni avverse a farmaci (ADR = Adverse Drug Reaction), pur se appropriatamente prescritti e somministrati, con più di 100.000 pazienti deceduti.

Variabilità della risposta ai farmaci

Variabilità della risposta ai farmaci Possibili cause dell’inefficacia o della reazione avversa ai farmaci Cause non genetiche Cause genetiche patogenesi e severità della malattia età del paziente funzione epatica e renale co-somministrazione di altri farmaci stile di vita e abitudini alimentari polimorfismo di geni codificanti proteine che influenzano il metabolismo, la biodisponibilità o l’effetto dei farmaci si calcola che circa il 25-50% dei casi di terapia inefficace o ADR siano dovuti a cause genetiche

Polimorfismo genico e SNPs Variazione della sequenza all’interno di un gene con successiva creazione di uno o più alleli presenti con frequenza di almeno l’1% all’interno di una popolazione Nel 90% dei casi si tratta di polimorfismi che riguardano un singolo nucleotide (SNP = Single Nucleotide Polimorphism) all’interno della sequenza codificante la proteina o della regione di controllo dell’espressione genica, il rimanente 10% è rappresentato da inserzioni, delezioni, ripetizioni in tandem e microsatelliti I polimorfismi sono alla base della variabilità genica tra un individuo ed un altro e possono influenzare l’attività, l’espressione, la degradazione e le caratteristiche delle proteine interessate La scoperta degli SNPs e’ stata possibile grazie al completamento del Progetto Genoma Umano avvenuto nel 2001 GATTTAGATCGCGATAGAG GATTTAGATCTCGATAGAG

Polimorfismo genico e Farmacogenetica E’ stato calcolato che nel genoma umano sia presente uno SNP ogni 1.000 paia di basi circa, per un totale di almeno 1,42 milioni di SNPs complessivi nell’intero genoma, almeno 60.000 dei quali situato in regioni codificanti I geni fondamentali per la produzione di proteine nell’uomo sono 30-40 mila e tra questi da 3.000 a 10.000 sono importanti per l’attività dei farmaci Il numero totale di patologie per le quali è stata identificata una mutazione genetica determinante è circa 1.500 Importanza della farmacogenomica per lo studio di malattie poligeniche (ad es. cardiovascolari ed oncologiche) e per l’individuazione dei farmaci più efficaci per la cura dei pazienti in base ai profili genici individuali

Banche dati delle SNPs Identificazione di nuovi SNPs nella popolazione Raccolta ed elaborazione dei dati tramite la bioinformatica Creazione di banche dati di pubblico dominio Nascita della biologia in silicio per identificare polimorfismi in regioni codificanti mediante algoritmi al computer che allineano EST (Expressed Sequences Tag) da sequenze sovrapposte

Effetti farmacocinetici e farmacodinamici di mutazioni Polimorfismi di geni codificanti proteine coinvolte in: metabolismo dei farmaci (es. attivazione di prodrugs o inattivazione di molecole attive) assorbimento, trasporto ed eliminazione dei farmaci (es. proteine trasportatrici di membrana) Polimorfismi di geni codificanti proteine recettori dei farmaci bersaglio dei farmaci EFFETTI FARMACOCINETICI EFFETTI FARMACODINAMICI

Esempi di mutazioni che influenzano l’attività di enzimi

Esempi di polimorfismo di enzimi metabolizzanti farmaci OSSIDAZIONE CONIUGAZIONE

Esempi di polimorfismo che influenzano gli effetti dei farmaci

Variabilità individuale nell’efficacia terapeutica dei farmaci Individuo normale collaterale Effetto Dose terapeutico Accettabile Non accettabile Efficacia ridotta

Variabilità individuale negli effetti collaterali dei farmaci collaterale Effetto Dose terapeutico Accettabile Individuo normale Non accettabile Aumento di effetti collaterali

Determinanti poligenici dell’effetto dei farmaci Polimorfismo enzima metabolizzante Polimorfismo proteina bersaglio Omozigote wt Eterozigote Omozigote mut

Storia della Farmacogenetica

Pre-genomica e Post-genomica

Applicazioni della Farmacogenetica Identificazione di pazienti che non rispondono (non-responders) o a rischio di ADR (toxic responders) per un determinato farmaco: verranno trattati solo i pazienti risultati responders, gli altri riceveranno una terapia alternativa o dosi ridotte del farmaco “Il farmaco giusto alla dose giusta per il paziente giusto”

Le promesse della Farmacogenomica Farmaci più potenti: scoperta di nuovi geni bersaglio associati alle malattie  farmaci più specifici e meno tossici Prescrizione di farmaci migliori e più sicuri: profilo genetico del paziente  giusto farmaco ad ogni paziente anziché metodo “tentativo ed errore” (es cura dell’ipertensione) Determinazione più accurata dei dosaggi: profilo genetico del paziente  calcolo del dosaggio in base alle caratteristiche genetiche e metaboliche individuali anziché peso ed età Screening preventivo e predittivo delle malattie: determinazione del codice genetico del paziente  possibilità di prevedere l’insorgenza di malattie genetiche ed adottare cure preventive o adeguati stili di vita Migliori vaccini: vaccini di DNA o RNA  attivazione sistema immunitario senza rischio di infezione, economici, stabili, più ceppi nello stesso vaccino Maggior efficienza nella scoperta di nuovi farmaci: caratterizzazione bersagli genomici  trials specifici per particolari gruppi genetici Diminuzione dei costi delle cure: diminuzione reazioni avverse o farmaci inefficaci, diminuzione trials falliti  diminuzione complessiva dei costi

Ostacoli allo sviluppo della Farmacogenomica Difficoltà nell’individuare i geni le cui variazioni influenzano l’effetto dei farmaci: spesso numerosi geni sono coinvolti nel metabolismo di un farmaco e gli effetti del loro polimorfismo possono sommarsi o annullarsi reciprocamente Limitata scelta di farmaci alternativi: per alcune patologie sono disponibili solo pochi farmaci con il rischio di non avere alternative terapeutiche per i pazienti risultati non trattabili con i farmaci convenzionali Scarso interesse delle società farmaceutiche nello sviluppo di farmaci alternativi: potrebbe non essere economicamente vantaggiosa la ricerca e la commercializzazione di farmaci alternativi per pazienti con polimorfismi rari Necessità di corsi di formazione per il personale medico: per l’applicazione delle tecniche di farmacogenomica e la corretta interpretazione dei risultati sono necessarie specifiche competenze soprattutto in campo genetico Problemi di carattere etico e di difesa della privacy: discriminazioni, problemi psicologici, conseguenze in campo lavorativo ed assicurativo

Test genetici: scopi, benefici e rischi

Tecniche utilizzate in Farmacogenetica

Individuazione di pazienti a rischio ADR Profilo SNP dei soggetti del clinical trial Nessun ADR durante i clinical trials Nessun ADR durante i clinical trials Manifestazione di ADR durante i clinical trials Profilo SNP dei pazienti Basso rischio ADR Alto rischio ADR SNP-LD: SNP Linkage Disequilibrium

Approcci per l’analisi delle variazioni farmacogenetiche

Approcci di tipo genomico Identificazione di un gene che influenza la risposta poligenica ad un farmaco Analisi di un gene candidato Approcci di tipo genomico

Esempio di progettazione di test diagnostico con microarray Sovraespresso Sottoespresso

La farmacogenetica e le terapie antitumorali Il dosaggio preciso del farmaco è particolarmente importante per gli antitumorali a causa del loro ristretto indice terapeutico Aumentando la dose di farmaco aumenta l’efficacia ma anche la probabilità di avere effetti tossici, è quindi importante valutare la dose che garantisce il massimo di efficacia con la minima tossicità: con la farmacogenetica si possono individuare i pazienti a rischio ADR e quelli che non rispondono al trattamento

Polimorfismi ed effetto sulle terapie antitumorali

Tiopurina metiltransferasi e terapia con mercaptopurina Test genetici o enzimatici su TPMT sono usati per determinare la dose corretta di tiopurine Thiopurine methyltransferase Hypoxanthine phosphoribosyl transferase Thioguanine nucleotides

Diidropirimidina deidrogenasi, timidilato sintasi e terapia con 5-fluorouracile (TS inhibitor)

Uridindifosfato glucuronosiltransferasi e terapia con irinotecan Nel 2005 l’FDA ha approvato l’uso del test clinico per l’allele UGT1A1*28 (inactive) (carboxylesterase) UGT1A1 = uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1A1 UGT1A1 Wild-type UGT1A1*28

Metabolismo dei folati e vie collegate, terapia con metotrexate 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase dihydrofolate reductase

Altri polimorfismi con effetto sulle terapie antitumorali GSTP1 (glutatione S-transferasi P1) Reagisce con vari farmaci antitumorali (es. ciclofosfamide, oxaliplatino) inattivandoli Polimorfismo GSTP1 I105V in circa 33% della popolazione caucasica GSTP1 I105V ha attività ridotta rispetto al wt: gli omozigoti presentano maggiore rischio di tossicità e aumentata risposta alla terapia rispetto ai wt, gli eterozigoti presentano tossicità e risposta intermedia Enzimi citocromo P450 dipendenti Reagisce con vari farmaci antitumorali attivandoli o inattivandoli Vari tipi di polimorfismo per gli enzimi di questa classe MDR1 (multidrug resistance-associated protein 1) o Glicoproteina-P E’ coinvolta nel trasporto transmembrana e nell’eliminazione di metaboliti endogeni e farmaci antitumorali Quando è overespressa può diminuire la risposta ai farmaci aumentandone la loro escrezione

Trastuzumab (Herceptin) ed oncogene ERBB2 (o HER2) ERBB2 = erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (o NEU2 = neuro/glioblastoma derived oncogene homolog) Appartiene alla famiglia dei recettori per l’EGF (epidermal growth factor) ed è presente sulla membrana cellulare, quando viene attivato stimola la crescita cellulare ERBB2 è associato ad alcuni tumori alla mammella: errori di replicazione del DNA portano alla formazione di copie multiple del gene (amplificazione genica) con aumento del numero di recettori sulla membrana e conseguente replicazione cellulare incontrollata. In circa il 25% dei tumori alla mammella si riscontra overespressione del gene ERBB2 con basso tempo di sopravvivenza libera da malattia e resistenza ad alcuni farmaci antitumorali. Nel 1998 l’FDA ha approvato l’utilizzo, per il trattamento del tumore metastatico alla mammella, di un anticorpo umanizzato ricombinante rivolto verso la proteina ERBB2: il Trastuzumab (o Herceptin della Genentech)

Trastuzumab (Herceptin) ed oncogene ERBB2 (o HER2) ERBB2 è un ottimo bersaglio per la terapia con Trastuzumab: Livelli strettamente correlati alla patogenesi e alla prognosi del tumore Livelli nelle cellule tumorali molto più elevati che nelle cellule sane (ridotta tossicità ed elevata specificità del trattamento) Espresso in un’altissima percentuale di cellule tumorali (elevata efficacia della terapia) Espresso sia nel tumore primario che nelle metastasi (trattamento efficace in tutte le sedi tumorali) Informazioni sulla prognosi ed evoluzione del tumore Individuazione dei pazienti trattabili con Trastuzumab Importanza dell’accurata determinazione dei livelli di espressione di ERBB2

Metodi d’analisi dell’espressione di ERBB2  

Terapia con Trastuzumab, associazioni e nuovi anti-ERBB2 Il Trastuzumab viene utilizzato quando ERBB2 è overespresso (IHC 3+) I trials clinici indicano una risposta del 12-26% dopo trattamento con Trastuzumab in monoterapia, spesso i pazienti che inizialmente rispondono alla terapia manifestano però una progressione entro 1 anno Studi di fase II per l’associazione con altri antitumorali (es. doxorubicina+ciclofosfamide, docetaxel, carboplatino, paclitaxel, vinorelbina, gemcitabina) indicano il 24-80% di risposte. Risultati promettenti per l’associazione trastuzumab-inibitori specifici (es. inibitore della tirosina chinasi anti-EGFR o inibitore della farnesil transferasi) Progettazione di nuovi farmaci anti-ERBB2 (es. Trastuzumab legato ad una tossina, inibitori specifici, vaccini a DNA)

K-RAS Mutation Assay: terapia con Cetuximab o Panitumumab in tumori iper-esprimenti EGFR EGFR (HER1 o ErbB1) = recettore della superficie cellulare stimolato da fattori di crescita e coinvolto nella crescita, replicazione e differenziazione cellulare. Alcuni tipi di cancro – in particolare polmone, prostata, colon-retto, ovaio, distretto cervico-facciale - iper-esprimono il recettore EGFR e questa iper-espressione è correlata alla metastatizzazione del tumore e ad una prognosi negativa. Per il trattamento di questi tumori sono attualmente utilizzati anticorpi monoclonali (ad es. cetuximab e panitumumab) che riconoscono la parte di recettore esposta verso l’esterno della cellula. Questi farmaci sono però molto costosi e causano importanti effetti collaterali. Studi recenti hanno inoltre dimostrato che i tumori colon-rettali iper-esprimenti il recettore EGFR che presentano mutazioni del gene K-RAS (circa il 40% del totale) sono resistenti al trattamento con anticorpi anti-EGFR. La proteina espressa da K-RAS è coinvolta nel meccanismo di trasduzione dei segnali di crescita cellulari mediato dal recettore EGFR: la mutazione rende K-RAS costitutivamente attivata e quindi in grado di stimolare la proliferazione cellulare indipendentemente dall’attività di inibizione degli anticorpi anti-EGFR. Recentemente è stato messo a punto il test “K-RAS Mutation Assay”, che consente di rilevare, nei pazienti affetti da tumore colon-rettale, la presenza di mutazioni del recettore EGFR e prevedere quindi quali pazienti potranno trarre beneficio dal trattamento con gli anticorpi.

Esempio di applicazione nello screening dei pazienti per l’individuazione di terapie mirate: lo studio ITACA International TAilored Chemotherapy Adjuvant (ITACA) trial su pazienti affetti da NSCLC (carcinoma polmonare non a piccole cellule) stadio II-IIIA Osservazioni sperimentali: L’Excision Repair Cross-Complementation 1 (ERCC1) è un gene coinvolto nella riparazione dei danni al DNA causati dal cisplatino o composti simili, è overespresso in molte cellule tumorali, il suo livello di espressione nel tumore di pazienti affetti da NSCLC è correlato con la risposta al trattamento con cisplatino più gemcitabina: i pazienti con bassi livelli di mRNA di ERCC1 rispondono meglio alla terapia ed hanno sopravvivenza mediana maggiore rispetto ai pazienti con alti livelli di mRNA. Il livello relativo di mRNA di ERCC1 espresso nel tessuto tumorale può essere inversamente associato con la risposta e la sopravvivenza, come un indicatore indipendente dell’efficacia del cisplatino. L’espressione della Timidilato Sintasi (TS), enzima bersaglio del 5-fluorouracile, è correlata alla risposta a questo farmaco: livelli elevati di TS in tumori gastrointestinali, mammari e in NSCLC sono associati a prognosi più infauste. I poliglutamil derivati del Pemetrexed inibiscono la TS, quindi pazienti che esprimono bassi livelli di TS dovrebbero rispondere meglio alla terapia con questo farmaco. Disegno dello studio: Pazienti affetti da NSCLC e sottoposti a resezione completa Analisi del livello di espressione dell'ERCC-1 e della TS tramite qRT-PCR su di un frammento del tessuto tumorale asportato Randomizzazione in un gruppo di controllo, trattato con terapie adiuvanti standard, o in un gruppo sperimentale trattato con terapia adiuvante personalizzata secondo l’appartenenza del paziente ad uno dei 4 diversi profili genetici Confronto dell’efficacia della terapia personalizzata rispetto alla standard

Come la farmacogenomica influenzerà… CONCLUSIONI Come la farmacogenomica influenzerà… …la ricerca per lo sviluppo di nuovi farmaci …il rapporto del paziente con medico e farmacista