INGEGNERIA DEI TESSUTI L’ingegneria dei tessuti nasce come tentativo di costruire tessuti ed organi al di fuori del corpo umano PRESUPPOSTO La quasi totalità delle cellule animali possono essere coltivate in laboratorio

RICOSTRUZIONE DI TESSUTO/ORGANO In vitro In vivo Ingegneria dei tessuti Induzione rigenerativa

Elementi base Componente biologica Cellule e/o fattori molecolari Ingegneria Tessutale Elementi base Cellule e/o fattori molecolari Componente biologica Supporto tridimensionale Biomateriale

Componente biologica Cellule: Ingegneria Tessutale differenziate indifferenziate

La cute CON L’INGEGNERIA TISSUTALE E’ OGGI POSSIBILE OTTENERE, A PARTIRE DA UNA PICCOLA BIOPSIA, TESSUTI DA TRAPIANTARE SU LESIONI CUTANEE

PELLE ARTIFICIALE Di solito, una ferita cutanea guarisce spontaneamente. In alcuni casi, però non si può attendere o non è facile ottenere il ripristino spontaneo: vaste ustioni ( se non si interviene c’è rischio di morte) ulcere croniche (dismetaboliche, vascolari, diabetiche ecc.) ulcere da decubito o da compressione vaste e profonde ferite chirurgiche

PELLE ARTIFICIALE L’auto-trapianto di lembi di cute rappresenta la soluzione migliore per la copertura di ferite difficili. quando ciò non è possibile (vaste ustioni, ferite croniche, ecc.), bisogna ricorrere alla pelle artificiale da una piccola biopsia di cute del paziente (2x2 cm) si può ottenere fino ad 1 mq di epidermide e di derma.

DERMA ARTIFICIALE Grazie alla tecnologia dei polimeri oggi si dispone di biomateriali tridimensionali all’interno dei quali si possono coltivare cellule dello stesso paziente (fibroblasti) che producono un tessuto simile al derma. con questa tecnica si è in grado di trattare numerose lesioni cutanee che vanno dalle vaste ustioni alle ulcere croniche e a quelle chirurgiche

PELLE La cute è un organo complesso che ricopre l’intera superficie corporea e svolge importanti funzioni: agisce da barriera protettiva nei confronti dell’ambiente esterno opponendosi al passaggio dei microrganismi e assorbendo le radiazioni; mantiene l’equilibrio idrico; partecipa alla regolazione della temperatura corporea; svolge un ruolo immunologico, grazie alla presenza di cellule immunocompetenti; funziona come organo di relazione, grazie alla presenza di una fitta rete nervosa ;

EPIDERMIDE: funzione di protezione Partendo dalla superficie ed arrivando in profondità la cute è costituita da un epitelio, l’epidermide; da un tessuto connettivo, il derma e da un tessuto adiposo chiamato sottocutaneo Nel derma e nel sottocutaneo sono contenuti gli annessi cutanei, i vasi e i nervi. L’epidermide è un epitelio squamoso pluristratificato in continuo rinnovamento costituito da quattro tipi di cellule: i cheratinociti, che rappresentano più del 99% delle cellule epidermiche e che sono responsabili dell’integrità dell’epidermide i melanociti, le cellule di Langerhans e le cellule di Merkel L'epidermide si accresce dalle cellule basali verso lo strato corneo, con un processo di cheratinizzazione che ha una durata di 3-4 settimane e che si conclude con la formazione di cheratina (ammassi cornei) a diretto contatto con l'esterno.

Cellule Staminali dell’epidermide L’epidermide è un epitelio dinamico che si rinnova continuamente per tutta la vita Il suo turnover è di circa 7 giorni nell’uomo. Questo rapido turnover nell’adulto richiede la presenza di stem cell capaci di dare origine a cellule mature

L’abilità dell’epidermide umana nel mantenere un costante turnover delle cellule è basata sulla presenza, nello strato basale, di una popolazione di cellule staminali di cheratinociti (stem cells), dotate d’alta capacità di auto-rinnovarsi durante la vita e con grande potenziale proliferativo. Le stem cell, a loro volta, generano cellule che vanno incontro a differenziazione terminale conosciute come “transient amplifying cells” (TA) che, prima di andare incontro a differenziazione terminale, mostrano una limitata capacità proliferativa . Esiste una popolazione intermedia di cheratinociti basali, detta “young TA”: questa popolazione si comporta in modo intermedio tra le stem cells e le TA cells . La differente capacità proliferativa di tali cellule è stata studiata molto accuratamente in coltura, valutando la loro efficienza nel formare colonie (CFE). Nell’ epidermide umana sono stati individuati tre tipi di cellule in grado di formare colonie: gli olocloni che sono considerati cellule staminali con la più alta capacità proliferativa; i paracloni (TA), che vanno incontro a differenziazione terminale dopo circa una decina di divisioni e i merocloni che si comportano in un modo intermedio fra i paracloni e gli olocloni.

Cellule Staminali dell’Epidermide Lo strato basale contiene due tipi di cheratinociti : Stem cells: indifferenziate, slowly-cycling, ampia capacità di proliferazione. Transit amplifying cell (TA): replicazione rapida, limitato potenziale proliferativo. Tre categorie di cheratinociti con capacità proliferativa: OLOCLONI MEROCLONI PARACLONI

Cellule Staminali dell’epidermide IL PASSAGGIO DA HOLO- A MERO- E A PARACLONE E’ IRREVERSIBILE Solo gli olocloni sono vere stem cell, in virtù della loro capacità di auto rinnovamento

Localizzazione delle stem cells nella pelle Epidermide: strato basale (organizzazione in clusters) strato spinoso e granulare follicoli piliferi (porzione esterna) Derma: follicoli piliferi cellule non follicolari Le stem cells del derma possono dare origine: -cellule neuronali (neuroni e glia) -derivati del mesoderma (osteociti, condrociti, cellule muscolari e adipociti) -cellule ematopoietiche

Cellule Staminali dell’epidermide Sono presenti anche tra i cheratinociti dellla guaina del bulbo pilifero

Cellule Staminali dell’epidermide Esterno Lo strato basale, contiene le cellule proliferanti che migrano verso gli strati superiori dove vanno incontro a differenziamento che porta alla formazione di cellule terminali prive di nucleo. Basale Epidermide

Cellule Staminali dell’epidermide

Organizzazione dei cheratinociti nell’epidermide umana

L’espressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al transit amplifying

Cellule Staminali dell’epidermide I marcatori sono: ß1 integrine p63 keratins 19 and 15 non-cadherin-associated ß-catenin

Integrine espresse nei cheratinociti a2b1 (collagen receptor) a3b1 (laminin receptor) a5b1 (fibronectin receptor) a6b4 (laminin receptor) avb5 (vitronectin receptor) Le stem cells esprimono alti livelli delle b1 integrine rispetto alle TA: questo consente di isolare ciascuna subpopolazione di cheratinociti e di determinarne la sua localizzazione a livello dell’epidermide

Caderine espresse nei cheratinociti E -P- caderine: molecole di adesione che mediano le adesioni intercellulari calcio-dipendente L’alterazione dell’espressione di tali molecole comporta una diminuzione della proliferazione dei cheratinociti ed un incremento del differenziamento terminale Le molecole di adesione rappresentano una importante componente della nicchia della cellula staminale

Prelievo e selezione della componente cellulare Le cellule possono essere isolate da un frammento di tessuto e separate in base alle loro caratteristiche Prelievo e selezione della componente cellulare CHERATINOCITI FIBROBLASTI CELLULE ENDOTELIALI ADIPOCITI … Hanno caratteristiche differenti a seconda della sede anatomica di prelievo

Cellule staminali ed ingegneria dei tessuti Prendiamo in esame alcuni casi applicativi. Il primo è la rigenerazione della cute

Vantaggi per l’utilizzo di cellule staminali epidermiche Le cellule sono facilmente accessibili ed isolabili (biopsia cutanea) Le cellule presentano alcuni privilegi immunitari (basso numero di cellule immunitarie) : potenziale uso per trapianti allogenici Utilizzo come bersaglio in terapia genica e in ingegneria tissutale

Prelievo di cute per la coltivazione dei cheratinociti E’ praticamente simile ad una biopsia cutanea. E’ necessario inviare al laboratorio un piccolo frammento di cute a tutto spessore del paziente (2 cm x 1 cm) prelevato da un’area sana, possibilmente nascosta (regione retroauricolare, regione inguinale) I cheratinociti coltivati saranno pronti dopo un tempo medio di circa tre settimane.

Tecnica di coltivazione dei cheratinociti su fibrina La fibrina non induce variazione clonale e perdita di cellule staminali epidermiche La velocità di crescita ed il potenziale di proliferazione non sono alterati dal nuovo sistema culturale L’attecchimento dei cheratinociti nei siti di innesto è alta, riproducibile e permanente La fibrina riduce significativamente i costi delle colture autogene ed elimina i problemi relativi al maneggiamento e trasporto

- fibrina + fibrina

I cheratinociti coltivati in vitro generano foglietti coesivi di epitelio stratificato che mantiene le caratteristiche dell’epidermide Colture di cheratinociti autologhi sono ampiamente utilizzate per il trattamento di estese aree ustionate e per la rigenerazione epidermica LIMITI: infezioni, preparazione del sito di innesto (dermoabrasione, escarectomia o necrectomia, escarotomia)

Ricostruzione in vitro di un equivalente epidermale Tecnica di Rheinwald & Green dopo 14 – 21 giorni 2cm2 2m2 Epithelial cells are cocultured with a feeder layer consisting of mouse 3T3 fibroblasts previously irradiated or mitomycin C treated to stop their proliferation and to prevent fibroblast invasion.28,29 The use of such feeder layers greatly improves epithelial cell proliferation and is a well recognized method to culture several types of human cells, including skin and corneal epithelial cells. The major advantage is the possibility to initiate a cell culture from a very small number of cells. Cocultured with a feeder layer, a single skin keratinocyte is capable of colony formation, and its proliferation capacity is considerably extended without losing its potential to differentiate.

dell’ingegneria tessutale Recenti conquiste dell’ingegneria tessutale EVOLUZIONE DELLE METODICHE DI COLTURA CELLULARE IN VITRO EVOLUZIONE DEI BIOMATERIALI

LAMINE DI CHERATINOCITI La sopravvivenza cellulare è direttamente correlata con le condizioni del letto ricevente. In particolare, la presenza di uno strato dermico ne incrementa la sopravvivenza Fibroblasti ECM Micro-vascolarizzazione

Primo “step”: construtto cutaneo doppio strato Due tipi cellulari La co-cultura di fibroblasti e cheratoniciti ha dimostrato la possibilità di ottenere un construtto cutaneo doppio strato, epidermico e dermico. a 7 days 7 giorni di co-cultura b 14 days 14 giorni di co-cultura

COLTURA COMPOSITA DI 3 TIPI CELLULARI FIBROBLASTI CELLULE ENDOTELIALI CHERATINOCITI PELLE ENDOTELIALIZZATA

Progressiva formazione di strutture microcapillari ad anello Progressivo inspessimento dello strato epidermico (Ab anti-pancitokeratine)

Immunolocalizzazione del CD31 a livello delle strutture microcapillari ad anello.

Strutture microcapillari evidenziate dalle cellule endoteliali positive al vWF (21 giorni di coltura composita)

Immunolocalizzazione dello strato epidermico e delle strutture micro-capillari. Cellule positive Anti- keratine e vWF Co-localizzazzione del vWf e della laminina a livello dei capillari

Il trattamento delle perdite di sostanza cutanea di diversa eziologia con un sostituto cutaneo provvisto di una rete microcapillare dovrebbe favorire l’integrazione in vivo del sostituto ed incrementare la velocità e qualità della guarigione.

MODELLI IN VITRO DI EPIDERMIDE UMANA While animal skin does not reflect the same barrier properties as human skin, human skin poses problems of procurement, high cost and large variations in results from donor to donor. Skin equivalents, such as the Human Skin Equivalent (HSE) or the commercially available model Epiderm FT are in vitro cultured skin models that can be used for testing the skin permeation of compounds, irritation and toxicology test This model is a full thickness reconstructed skin that has been cultured in modified conditions to develop a permeability barrier closer to that of human skin in vivo.

Development of the HSE Dermal matrix: Dermal tissue was made by contraction of bovine Type I collagen by dermal fibroblasts. Formation of epidermis: Neonatal Keratinocytes (~700,000 per layer) were seeded on top of the dermal layers, allowed to attach and grown submerged in media for 7 days. Formation of full thickness HSE: The skin cultures were exposed to theALI (Air Liquid Interface) to allow differentiation of the basal epidermal layer into a multilayered epidermis, including the stratum corneum. For modified HSE :During culture at the ALI for 21 days, the skin was fed with modified media consisting of external fatty acids, ascorbic acid and PPAR-α agonist

The HSE demonstrated a multilayered and differentiated epidermis with all epidermal layers including stratum corneum. .

Lipid profiles of the HSE (modified and control) and human skin. Note: HSE control: without fatty acids, ascorbic acid and PPAR-α agonist) The lipid profile of the modified HSE was closer to human skin than the control HSEs, and demonstrated higher amounts of ceramides that are essential for skin barrier function. Fatty acids 10.1 ± 0.5 6.7 ± 0.6 8.1 ± 0.6 Cholesterol 25.3 ± 3.1 25.9 ± 3.6 19.4 ± 2.9 Ceramides 14.1 ± 0.5 8.6 ± 1.4 12.2 ± 2.2 Phospholipids 23.8 ± 2.1 19.5 ± 3.8 39.2 ± 2.1 HSE Modified HSE control Human skin The data is expressed as mean percent of total lipids ± SD.

RICOSTRUZIONE DI TESSUTO/ORGANO MEDICINA RIGENERATIVA In vitro In vivo Ingegneria dei tessuti Induzione rigenerativa

Ingeneria dei tessuti in vivo Sfrutta la possibilità di utilizzare biomateriali “biomimetici” in grado di orchestrare gli eventi rigenerativi direttamente in vivo, senza pre-trattamenti cellulari o farmacologici in vitro. Ha come obiettivo principale quello di sviluppare una protesi biocompatibile, con caratteristiche meccaniche idonee a mantenere le condizioni fisiologiche di flusso, fintantoché non sono terminati i processi di rimodellamento cellulare che porteranno alla rigenerazione di un nuovo tratto arterioso. La possibilità di avere un biomateriale in grado di essere rimodellato in vivo rappresenta l’evento fondamentale per ottenere una protesi vascolare ideale.

MEDICINA RIGENERATIVA Induzione in vivo di un nuovo organo o tessuto con le stesse proprietà fisiologiche dell’organo perduto. La medicina rigenerativa è il nuovo obiettivo della ingegneria dei tessuti Scaffold riassorbibile In grado di orchestrare in vivo gli eventi rigenerativi Che viene completamente riassorbito a rigenerazione avvenuta

IN VIVO TISSUE ENGINEERING Utilizzo di un biomateriale che avesse la sola funzione di guida temporanea per i processi di rigenerazione e rimodellamento vascolari. In grado quindi di promuovere ed ordinare la rigenerazione della parete vascolare nel sito anatomico di impianto. IN VIVO TISSUE ENGINEERING APPROACH “INTELLIGENT” TEMPORARY VASCULAR CONDUIT ABAT: Artery Bio-regeneration Assit Tube HYAFF 11™ Length: 1 cm Diameter: 2mm 30 Wistar rats

L’acido ialuronico è ben conosciuto per la sua biocompatibilità, biodegradabilità e per la sua capacità di promuovere l’adesione e proliferazione delle cellule endoteliali. Remuzzi A, Mantero S, Colombo M, Morigi M, Binda E, Camozzi D, Imberti B. Vascular smooth muscle cells on hyaluronic acid: culture and mechanical characterization of an engineered vascular construct. Tissue Eng. 2004;10(5-6);699-710. Turner NJ, Kielty CM, Walker MG, Canfield AE. A novel hyaluronan-based biomaterial (Hyaff-11) as a scaffold for endothelial cells in tissue engineered vascular grafts. Biomaterials. 2004;25(28);5955-5964. Tonello C, Vindigni V., Zavan B, Brun P., Abatangelo S., Abatangelo G. and Cortivo R. In vitro reconstruction of an endothelialized skin substitute provided with microcapillary network using biopolymer scaffold. FASEB J. 12.07.05, 2005 (on line).

Le protesi tubolari (HYAFF-11™ tubules, 2 mm diameter, 1 cm length) sono state innestate a livello dell’aorta addominale di 30 ratti. a ABAT 1 cm b 1 cm c 1 cm e 1 cm d

Impianto della protesi 2 cm 2 mm AORTA ADDOMINALE ABAT

Cellule Endoteliali Progenitrici 5 GIORNI vWF e VEGFR-2 f CD34 g ↓CD133+/CD34+/VEGFR-2+ Cellule Endoteliali Progenitrici Circolanti E’ evidente la positività del lume interno, a marcatori quali vWF e VEGFR-2 per le cellule endoteliali ed al CD34 per le cellule progenitrici.

15 GIORNI Cellule positive per il vWF tapezzano il nuovo lume vascolare Le cellule endoteliali sono anche evidenziate dalle indagini di microscopia elettronica

30 GIORNI Il biomateriale è ancora integro ed il nuovo tessuto vascolare scorre dall’anastomosi prossimale a quella distale, sia lungo la superficie interna che esterna della protesi.

A 180 giorni dall’impianto il biomateriale è completamente riassorbito. La nuova arteria mantiene la propria struttura e le proprietà meccaniche. Il lume è pervio senza segni di dilatazione o collasso. Il biomateriale è assente e sostituito dal nuovo tessuto avventizio

Conclusioni Seguendo i principi della ingegneria dei tessuti è possibile ottenere un sostituto cutaneo composito, originato dalla co-cultura di differenti popolazioni cellulari autologhe. Il biomateriale a base di acido ialuronico è risultato essere un valido substrato per supportare la crescita e la differenziazione di cheratinociti, fibroblasti e cellule endoteliali.

Conclusioni Per quanto riguarda la rigenerazione in vivo è possibile guidare i processi biologici utilizzando opportuni scaffolds. Protesi che agiscono come semplici guide biologiche e che consentono alle cellule mesenchimali vascolari di scorrere lungo il supporto senza infiltrarlo; Protesi vascolari di piccolo calibro pronte da utilizzare senza l’utilizzo di cellule o precondizionamenti biochimici; Protesi in grado di essere degradate completamente dopo 4/5 mesi senza provocare alcun effetto collaterale.