Diagnostica molecolare Clinica IX lezione

La tipizzazione individuale genetica L’insieme delle tecniche utilizzate per l’analisi delle differenze presenti nel genoma umano nei diversi individui. “L'impronta digitale genetica" è, virtualmente, unica per ciascun individuo.

La medicina legale si occupa dei rapporti tra la medicina e la legge. Medicina giuridica, che si occupa dell'interpretazione delle norme e della loro applicabilità dal punto di vista medico. Medicina forense, che utilizza la medicina al fine di accertamento di singoli casi di interesse giudiziario. Studio dell’identità 1237 epoca in cui furono raccolti i primi documenti medievali di rilevanza medico-legale sono le Decretali di Papa Gregorio IX. XIX –XX secolo Cesare Lombroso, per il quale sorge la nuova figura del criminale e con essa la nuova concezione legale concernente il suo operato. Connessa a questa nuova concezione è tutta la serie di ricerche che condussero alla costituzione della polizia scientifica, basata su concetti ben determinati e tali da inquadrare questa importante attività dello Stato nei limiti di una vera scienza che si giova di numerosi apporti di ricerche e scoperte di scienze collaterali. Importanti furono anche quelle ricerche concernenti lo studio della identità che egli raccolse nel libro La medicina legale del cadavere.

Concetto di identificazione Identificare > attribuire esatte generalità METODI DI IDENTIFICAZIONE Documenti di identità Caratteri antropometrici (altezza, caratteristiche somatiche ecc.) Impronte digitali Identificazione anagrafica

.....gran parte del genoma si è conservato...... 98.8% Studi di genomica comparata indicano che gran parte del genoma si è conservata nel tempo tanto che...

Molto simili ma diversi…

99.5% del genoma umano è identico È lo 0.5% del loro DNA che li rende differenti “Capire le differenze e le similitudini è cruciale nella vita ed in medicina”

0.5% del patrimonio genetico rende ogni individuo UNICO

Analisi delle diversità Per… Definire l’identità

Metodi per l’ identificazione individuale fingerprinting Dal 1901 Dal 1986

Tenendo conto che .... Ogni persona ha un unico profilo di DNA (eccetto i gemelli omozigoti) Il DNA di ogni persona è lo stesso in ogni cellula. Un profilo di DNA rimane lo stesso durante la vita. La metà del DNA di un individuo proviene dalla madre e una metà dal padre.

Con il fingerprinting Cosa viene analizzato nel DNA? Il profilo del DNA dipende da regioni di DNA non codificante che mostrano una grande variabilità tra gli individui Variabilità genetica

Variabilità del genoma umano Il DNA è polimorfico POLIMORFISMI di interesse forense: - di sequenza - di lunghezza

Polimorfismi di sequenza (SNPs) ATGAATGCGTTACTGAATGACTTTCG TACTTACGCAATGACTTACTGAAAGC Rs3130315 Chr 6 ATGAATGCGCTACTGAATGACTTTCG TACTTACGCGATGACTTACTGAAAGC

Polimorfismi di lunghezza (ShortTandem Repeats) Omozigote 5-5 Allele 1: AT GACT GACT GACT GACT GACT TTCG Allele 2: AT GACT GACT GACT GACT GACT TTCG Locus vWA Eterozigote 3-4 I polimorfismi di lunghezza sono definiti anche coma microsatelliti Allele 1: AT GACT GACT GACT TTCG TAGG AAGT Allele 2: AT GACT GACT GACT GACT TTCG TAGG

Polimorfismi genetici Si definiscono microsatelliti (o short tandem repeats o STR) sequenze ripetute di DNA non codificante costituiti da unità di ripetizione molto corte (1-5 bp) disposte secondo una ripetizione in tandem, utilizzabili come marcatori molecolari di loci. La loro presenza nel genoma umano non influisce per più del 3%, ma si pensa che comunque essi svolgano una funzione essenziale per la struttura dei cromosomi

I polimorfismi del DNA si ereditano Allele 1: TAT GACT GACT GACT Allele 2: TAT GACT GACT GACT GACT Allele 1: CAT GACT GACT Allele 2: TAT GACT GACT GACT GACT GACT vWA - Eterozigote 3-4 vWA - Eterozigote 2-5 Allele 1: CAT GACT GACT Allele 2: TAT GACT GACT GACT GACT Allele di provenienza paterna Allele di provenienza materna vWA - Eterozigote 2-4

Con l’identificazione della variabilità genetica..... L’evoluzione delle tecniche di biologia molecolare ha consentito un loro sempre più largo impiego in ambito civile come strumento indispensabile per la risoluzione di casi giudiziari. ad esempio consentendo di poter raffrontare il DNA del sospettato ed il profilo genetico ottenuto dalle tracce biologiche oggetto di “repertazione” sul luogo di un reato. ottenere una comparazione utile ai fini di una compatibilità biologica tra padre , figlio e madre

Medicina Forense La tipizzazione del DNA ha trovato largo impiego Indagini Criminalistiche (traccia biologica/indagato) Indagini di paternità (figlio/presunto padre) Vittime di Catastrofi DNA da Resti biologici /DNA di parenti /DNA di riferimento

Concetto di identificazione ...Oggi in medicina legale l'identificazione è il riconoscimento, prima generico, mirato a stabilire la natura del materiale in esame, biologico e non, come capelli, sangue, sperma, latte, sudore, ossa, impronte, scrittura, proiettili sparati o i bossoli delle armi da fuoco; «poi la sua appartenenza a una determinata specie animale (diagnosi specifica) e infine la sua appartenenza a un determinato e più ristretto gruppo di individui o addirittura a un determinato soggetto (diagnosi individuale). Tale studio comporta una serie di indagini complesse: morfologiche, radiografiche, sierologiche.............genetiche

QUALI SONO I POLIMORFISMI GENETICI UTILIZZATI MEDICINA FORENSE

POLIMORFISMI GENETICI più frequentemente UTILIZZATI La presenza quindi nel genoma umano dei polimorfismi siano essi SNPs o STR fa si che questi polimorfismi siano adoperati come marcatori genetici per la tipizzazione individuale La presenza quindi nel genoma umano dei polimorfismi siano essi SNPs o STR fa si che questi polimorfismi siano adoperati come marcatori genetici per la tipizzazione individuale ed in particolare nell’ambito della: caratterizz del sesso, etc

Marcatori polimorfici degli autosomi, del mtDNA e del cromosoma Y Autosomi: cromosomi non sessuali mtDNA

Analisi identificative genetico forensi caratterizzando uno specifico set di 10-15 STR (short tandem repeat) sui cromosomi definiti autosomi è possibile definire uno specifico profilo genetico, peculiare di ogni singolo soggetto. Tale profilo (ad esempio di un soggetto indagato) viene confrontato con il profilo genetico (ad esempio della traccia biologica rinvenuta sul luogo del reato.) Gli autosomi sono i cromosomi non sessuali

CARATTERIZZAZIONE DI STR AUTOSOMICHE FORENSE D13S317 CSF1PO D5S818 D21S11 TH01 TPOX D7S820 D16S539 D18S51 D8S1179 D3S1358 FGA VWA AMEL D19S433 D2S1338

CARATTERIZZAZIONE DI STR PER LA DETERMINAZIONE DEL SESSO L’allineamento tra il gene dell’amelogenina umana presente sul cromosoma X e il gene dell’amelogenina umana presente sul cromosoma Y ha messo in evidenza alcune differenze.   In particolare c’e una regione lunga 106 bp sull’X e 112 bp sull’Y  L’amplificazione di questa regione permette di distinguere tra ♀ e ♂ ♀ (X X): se c’è una unica banda da 106 bp ♂(X Y): se ci sono due bande, una da 106 bp e una da 112 bp I marcatori associati all’Y sono sempre anch’essi anche adoperati in medicina forense Amelogenina: proteina presente nello smalto dei denti

CARATTERIZZAZIONE DI STR ASSOCIATE AL CROMOSOMA Y

....Ulteriori indagini possono essere condotte attraverso la caratterizzazione dei polimorfismi del DNA del cromosoma Y e del DNA mitocondriale. Tali marcatori sono utili nel caso di ricostruzione di rapporti parentali rispettivamente per linea paterna (Y) e per linea materna (DNA mitocondriale).

Infatti la particolare modalità di trasmissione di tali marcatori genetici consente un’identificazione individuale comparando i dati genetici (aplotipo) di un qualsiasi parente anche di lontano grado pur correlato in linea paterna (per quanto riguarda i marcatori del cromosoma Y umano) e materna (per il DNA mitocondriale) al soggetto da identificare.

Iter diagnostico della tipizzazione genetica mediante fingerprinting in medicina forense

Fasi procedurali I soggetti vengoni identificati attraverso un documento con foto o attraverso un loro rappresentante legale Dopo un colloquio informativo, viene raccolto il consenso informato Viene assegnato un codice identificativo all’indagine e ai singoli campioni

Fasi procedurali Un campione biologico viene raccolto, nel caso ad es. di un test di paternità, alla madre, al figlio e al presunto padre

DA DOVE E’ POSSIBILE ESTRARRE IL DNA?

Tipi di DNA DNA nucleare DNA mitocondriale

Tappe dell’analisi del DNA STR mediante fingerprinting Estrazione del DNA dal reperto biologico Amplificazione delle STR (short tandem repeats) Corsa elettroforetica Validazione statistica STR

Fasi procedurali Da ciascun campione viene estratto il DNA

Fasi procedurali Vengono amplificate tramite PCR (multiplex) le STR utilizzando primers marcati con fluorocromi differenti per differenti gruppi di STRs. Attualmente viene utilizzato un kit, AmpFlSTR Identifiler TM PCR Amplification Kit che permette di analizzare 15 STR più un locus per la determinazione del sesso

Fasi procedurali I campioni amplificati vengono separati mediante elettroforesi capillare sull’analizzatore genetico ABI PRISM 3130

Elettroforesi capillare: Prodotto di PCR viene iniettato nel capillare ripieno di un polimero Si applica corrente elettrica Il DNA si muove vero il polo positivo Il DNA viene separato in base alla sua lunghezza in bp Detector Window viene rilevata la fluorescenza specifica del prodotto di PCR attraverso un sistema di detection

Le bande, la cui dimensione dipende dal numero di ripetizioni, vengono trasformate in picchi. Il software GENEMAPPER facendo riferimento ad uno standard di peso molecolare identifica i picchi (alleli) di ciascun locus assegnando ad ognuno un numero che corrisponde al numero di ripetizioni

CARATTERIZZAZIONE DI STR AUTOSOMICHE FORENSE Elettroferogramma v D13S317 CSF1PO D5S818 D21S11 TH01 TPOX D7S820 D16S539 D18S51 D8S1179 D3S1358 FGA VWA AMEL D19S433 D2S1338 La determinazione del profilo genetico comporta la genotipizzazione di 16 regioni STR del DNA (loci) altamente polimorfiche in lunghezza, variabili da individuo ad individuo.

USO DELLE STR NELLA TIPIZZAZIONE INDIVIDUALE Allele1AT GACT GACT GACT GACT GACT GACT GACT TTCG Allele2AT GACT GACT GACT GACT GACT GACT GACT GACT GACT TTCG Rossi Paolo locus vWA 7-9

I risultati nelle indagini di paternità La compatibilità genetica La incompatibilità genetica

USO DELLE STR NELLA DIAGNOSI DI ATTRIBUZIONE DI PATERNITÀ Padre Figlio Madre

USO DELLE STR NELLA DIAGNOSI DI ESCLUSIONE DI PATERNITÀ Padre Figlio Madre

ATTRIBUZIONE DI PATERNITA’ Se il figlio oggetto di indagine presenta caratteristiche genetiche (alleli) riscontrate nel profilo genetico del presunto padre quest’ultimo può essere considerato il padre biologico Viene effettuata un’analisi statistica dei risultati e viene fornita una percentuale di attribuzione che sarà tanto più prossima al 100% quanto maggiore sarà il numero di regioni polimorfiche del DNA analizzate La determinazione del profilo genetico di un individuo si basa sull'analisi di un numero di loci polimorfici sufficiente per ottenere una probabilità di paternità superiore al 99,999%

Analisi di 15 STR Marcatore Padre Figlio/a Madre D8S1179 11/12 11/15 8/15 D21S11 30/31.2 31.2/32.2 32.2/33.2 D7S820 10/10 10/11 11/11 CSF1PO 12/12 8/12 8/11 D3S1358 14/19 17/19 17/18 TH01 6/7 6/7 6/6 D13S317 11/11 11/11 10/11 D16S539 10/11 11/13 12/13 D2S1338 17/18 18/21 16/21 D19S433 14/15 15/15 14/15 VWA 18/18 18/18 17/18 TPOX 8/9 8/8 8/8 D18S51 17/18 12/17 12/14 D5S818 10/13 10/11 11/11 FGA 21/26 21/21 21/24 Analisi di 15 STR ATTRIBUZIONE della paternità di XXX (Presunto Padre) nei confronti di XXX (figlia) con una probabilità di paternità maggiore del 99,999%

Referto

ESCLUSIONE DI PATERNITA’ Se il figlio oggetto di indagine presenta caratteristiche genetiche (alleli) non riscontrate nel profilo genetico del presunto padre quest’ultimo non può essere considerato il padre biologico

Incompatibilità genetica: esclusione di paternità Devono essere presenti almeno 2 marcatori incompatibili su 15

Risultati per identificazione individuale nelle indagini criminalistiche La Compatibilità genetica L’Incompatibilità genetica

“Accertare sui reperti, in particolare fazzolettini di carta e indumenti indossati dalla --------, la presenza di tracce biologiche specificandone la natura, e in caso di riscontro positivo effettuare comparazione con il profilo genetico degli indagati e della persona offesa -------, nonché quanto altro utile ai fini di giustizia”.

IL RISULTATO DELL’ANALISI DEL DNA ATTRIBUZIONE l’indagato e la traccia biologica analizzata hanno lo stesso profilo genetico ESCLUSIONE l’indagato e la traccia biologica analizzata non hanno lo stesso profilo genetico • RISULTATO NON CONCLUSIVO (ad es.per scarsa quantità o qualità del DNA)

Indagini criminalistiche (attribuzione) Quanti “punti” identici devono essere rivelati sulla molecola del DNA per poter attribuire con certezza una traccia biologica ad una persona ?

Per le impronte digitali se su un frammento di impronta vengono rinvenuti almeno 14 punti caratteristici e gli stessi punti vengono trovati sull’impronta assunta ad una persona, possiamo legittimamente asserire che si tratta della stessa identica persona. Per il DNA non esiste un limite superato il quale l’identità può ritenersi accertata

Drop out allelico Falsi picchi Problemi per l’utilizzazione dei marcatori polimorfici in ambito forense Drop out allelico Falsi picchi

Problemi: Dropout allelico 1500 Campione di riferimento Campione da analizzare 150 ? Quando il DNA estratto è molto scarso o fortemente degradato si può verificare che uno solo dei due alleli ad un locus venga amplificato. Nella figura l’allele 14 al sito D13S317 non si è amplificato: Falso omozigote 8/8, in realtà eterozigote 8/14

DNA DEGRADATO…

Conseguenze del DNA degradato 0039-0874-404-229 ---0874--404--- 0039------229 Si riduce la specificità dell’informazione

Problemi: falsi picchi Negli elettroferogrammi possono presentarsi dei falsi picchi dovuti a problemi tecnici e/o biologici. Questi picchi possono essere interpretati erroneamente come alleli

Altri tipi di POLIMORFISMI GENETICI UTILIZZATI STR CROMOSOMA Y SNP MITOCONDRIALI

Studio del cromosoma Y

APPLICAZIONI Nei disastri che coinvolgono intere famiglie, consente di confermare, nei soli soggetti di sesso maschile, l’appartenenza alla linea paterna Altre applicazioni in campo forense Miscele di DNA maschile e femminle Miscele di DNA di più soggetti maschi

Ereditarietà del cromosoma Y

Y-STRs ~99% delle violenze viene commesso da uomini 4/28/2017 Y-STRs ~99% delle violenze viene commesso da uomini L’analisi del DNA di un maschio sospettato misto a quello della vittima femmina può risultare molto difficile.

APPLICAZIONI DEI POLIMORFISMI DEL CHR Y PER DETERMINARE NELLA LINEA ANCESTRALE UN LEGAME PATERNO COMUNE Osservando i marcatori del cromosoma Y in tutti i maschi della stessa discendenza paterna ci si può aspettare che tutti i maschi correlati abbiano in comune gli stessi alleli del cromosoma Y (e quindi il medesimo profilo). Profili identici Y-STR indicano l'attribuzione in una determinata famiglia, mentre profili diversi indicano l'esclusione.

ySTR

ySTR I risultati dell'analisi vengono confrontati con database di dati popolazionistici di aplotipi Y

ySTR

DNA mitocondriale Nell'uomo i mitocondri sono ereditati per linea materna. In assenza di mutazioni, ciascuno eredita un DNA mitocondriale identico a quello della madre. Nella 2° generazione e in quelle successive, solo i discendenti per linea materna condividono lo stesso DNA mitocondriale.

Applicazioni in Medicina Forense Determinazione della parentela di due o più persone attraverso la linea materna. Ad esempio: - per stabilire se fratelli e sorelle presunti sono figli della stessa madre - per stabilire le relazioni di parentela dal lato materno della famiglia (zii, zie, nonne, ecc.), - come alternativa al classico test del DNA in casi forensi, quando la concentrazione di DNA nel campione sia molto bassa o degradata. Il vantaggio di usare il DNA mitocondriale risiede nel fatto che se non è possibile ottenere un campione di DNA dalla madre, può anche essere utilizzato un campione prelevato dalla nonna o di un’altro parente materno.

Applicazioni in medicina forense dei polimorfismi del DNA mitocondriale Lo studio dei polimorf del cromosoma y e del DNA mitoc. Sono sttai impiegati

La tipizzazione del DNA Si applica quando i primi strumenti di identificazione falliscono La tipizzazione del DNA può essere utilizzata in qualsiasi tipologia di disastro di massa Incidenti (aerei, treni, edifici collassati) Naturali (terremoti, uragani, inondazioni, tsunami) Guerre e bombardamenti

IDENTIFICAZIONE DI VITTIME DI INCIDENTI, STRAGI Viene raccolto il sangue dei parenti delle persone scomparse Vengono analizzate la regione del DNA mitocondriale ed alcuni STR Viene estratto il DNA dai resti delle vittime non identificate Viene analizzato il DNA delle vittime Viene paragonato il profilo genetico delle vittime con quello dei parenti Il confronto dei profili del DNA dei parenti con quello delle vittime permette di identificare le vittime

Il progetto ha generato Identificazione delle persone disperse nel World trade center in seguito ad attacco terroristico del 11/09/01 Il progetto ha generato 52,000 profili STR 44,000 profili mtDNA 17,000 profili SNPs 850 delle 1594 vittime identificate grazie all’analisi del DNA