Biogenesi dei MicroRNA -Biogenesi alternative dei MicroRNA: pathway canonico da miRNA gene MirtronPathway da introni

E’ stato ipotizzato che esistono varie possibilità attraverso cui RISC può attuare il blocco della traduzione miRNA-mediato. Modalità d’azione dei miRNA

Il riconoscimento del messaggero è dovuto maggiormente alla presenza di una “Seed sequence” al 5’ del miRNA. Sequenze seed

Posizionamento dei miRNA al 3’-UTR dell mRNA

P53 è una proteina che in risposta a stress genotossici, stress cellulari e inadeguati segnali proliferativi media una serie di risposte, dipendenti dal contesto cellulare, che includono arresto del ciclo cellulare, apoptosi e riparo del danno. P53

G1G1 Stimolo mitogenico S Check point Pathway classico di attivazione di p53

I geni dei miRNAmir-34a,b,c sono compresi nel programma trascrizionale mediato da p53

Analisi bioinformatica dei promotori dei mir-34s

Conferma sperimentale del legame di p53 al promotore della famiglia de miRNA-34s ChIP Luciferase-assay ChIP allestita con linee p53 WT e p53-null trattate con Adriamicina.(MEFs) Trasfezione plasmidi contenenti promotori WT e mutati dei mir-34s a monte del gene luc, cotrasfettati con p53.(MEFs)

Correlazione dell’espressione dei mir34-s con lo stato di p53 Espressione dei mir34-a,b,c in due differenti sistemi:  a) MEFs che esprimono un plasmide p53 shRNA sopprimibile con tetraciclina  b) WT mice e p53 -/- mice, sottoposti a radiazioni ionizzanti.

Epatocarcinoma indotto in vivo, e successiva valutazione degli effetti della accensione di p53

p53 esplica le sue funzioni maggiormente attraverso l’apoptosi o l’inibizione della proliferazione mediante l’arresto del ciclo cellulare o attraverso senescenza Proliferazione delle cellule IMR90 dopo infezione con vettori retrovirali esprimenti mir34-a (quadrati), mir34-b/c (cerchi) e vettore di controllo (rombi). Blocco della proliferazione dovuto all’arresto del ciclo cellulare in G1/G2. G1- bianco G2- grigio S- nero

Oltre agli effetti sul ciclo cellulare, è stata evidenziata la presenza di alterazioni morfologiche caratteristiche della senescenza cellulare.

Per valutare l’azione molecolare dei mir-34 a,b,c sono state studiate le proteine che venivano fortemente down-regolate a 24h dopo trasfezione Western Blot per valutare l’abbassamento dei target Saggio di luciferasi per valutare l’interazione diretta tra il mir34-a e la 3’-UTR del gene target

L’attivazione di p53 porta all’induzione coordinata di più effettori a valle, spesso a funzione ridondanti. Nel blocco del ciclo cellulare, la proteina fondamentale è p21, ma la sua perdita non impedisce a p53 di esplicare le sue funzioni di arresto. Sono state evidenziate delezioni frequenti in tumori umani nel locus che codifica per i mir-34s, che sottolineano l’importante funzione di oncosoppressori detenuta da questa famiglia di microRNA.

Grazie per l’attenzione