La centrifugazione differenziale di un omogenato di cellule eucariotiche permette di separare i componenti cellulari (frazione nucleare, frazione mitocondriale, frazione microsomiale, citosol ecc.) Tale separazione si basa sulla diversa velocità di sedimentazione di particelle con diversa forma e densità quando sono sottoposte ad un campo centrifugo Le prime particelle che sedimentano sono quelle di maggiori dimensioni. Se le particelle hanno la stessa massa, ma densità differente, sedimenteranno prima quelle a densità maggiore, seguite da quelle di uguale massa ma densità minore

Le proteine si possono PURIFICARE sfruttando SOLUBILITA’ DIMENSIONE CARICA ELETTRICA AFFINITA’ PER ALTRE MOLECOLE

Le proteine possono essere frazionate sulla base della loro solubilità Frazionamento con sali Frazionamento con solventi organici Frazionamento con polimeri organici Frazionamento per denaturazione al calore Frazionamento in base al punto isoelettrico Ottima procedura iniziale per l’allontanamento della maggior parte dei contaminanti

FRAZIONAMENTO CON SALI E’ condotto con piccole aggiunte di un sale appropriato L’ammonio solfato è il sale più utilizzato, in quanto molto solubile in acqua, disponibile con un buon grado di purezza ed economico Dopo ogni aggiunta di sale bisogna essere sicuri di ottenere una soluzione omogenea con il sale completamente sciolto La proteina precipitata è centrifugata e risospesa in un’opportuna soluzione tampone Per ridurre al minimo la denaturazione, tutti i passaggi sono condotti tra 0°C e 10°C

SALTING OUT Fenomeno per il quale una data proteina precipita in un piccolo intervallo di concentrazione di sale (di solito ammonio solfato) Il fenomeno è da attribuire al fatto che le interazioni proteina-proteina divengono predominanti rispetto alle interazioni proteina-acqua e proteina-sale L’aggiunta di sale rimuove il sottile strato di molecole di acqua dalla superficie della proteina, consentendo ai gruppi idrofobici di causare l’aggregazione delle proteine e quindi la precipitazione La presenza di gruppi idrofobici in una proteina risulta fondamentale per il processo di salting out

Il frazionamento con sali si rivela utile solo quando le proprietà di solubilità della proteina di interesse sono diverse da quelle della maggior parte delle proteine contaminanti presenti nell’estratto L’estratto grezzo viene portato ad una concentrazione di ammonio solfato appena al di sotto di quella necessaria a precipitare la proteina di interesse per poter allontanare le proteine che precipitano mediante centrifugazione La concentrazione di ammonio solfato è poi aumentata in modo da far precipitare la maggior parte della proteina di interesse in un intervallo di tempo ragionevole La proteina precipitata viene recuperata mediante centrifugazione

La solubilità delle proteine varia con la concentrazione salina NaCl Na2SO4 (NH4)2SO4 Solubilità proteina Piccole quantità di sali stabilizzano le proteine in soluzione perché agiscono da controini (salting in). Se la concentrazione del sale aumenta però si ha una diminuzione di solubilità. Infatti le molecole di sale devono esse stesse idratarsi e sottraggono il sottile strato di acqua che ricopre le molecole. Le interazioni idrofobiche tra le molecole stesse diventano predominanti e le proteine aggregano e precipitano (saling out). [SALE] 9

Proteine del siero Fibrinogeno: 0.8 M (NH4)2SO4 Aggiunta di sale/ centrifugazione Aggiunta di sale/ centrifugazione Proteine del siero Fibrinogeno: 0.8 M (NH4)2SO4 Albumina: 2,4 M (NH4)2SO4

FRAZIONAMENTO CON SOLVENTI ORGANICI Si basa sulle differenze nella solubilità delle diverse proteine in soluzioni acquose di solventi organici quali etanolo, acetone, butanolo ed il glicole polietilenico (PEG) PEG = HO(CH2CH2O)nH (polimero organico) Il solvente organico abbassa la costante dielettrica del mezzo, determinando un incremento delle interazioni elettrostatiche tra diverse proteine a discapito delle interazioni proteina-acqua LA SOLUBILITA’ DI UNA PROTEINA DIMINUISCE Il frazionamento con solventi organici in un certo senso è l’inverso del frazionamento con sali: nel primo, i gruppi idrofobici delle proteine sono mascherati dal solvente organico mentre i gruppi ionici diventano dominanti; nel secondo, i gruppi idrofobici vengono progressivamente esposti SVANTAGGI: la tecnica provoca la denaturazione o l’inattivazione di molte proteine. Tuttavia per quelle proteine che sopravvivono al trattamento, questi possono essere passaggi potenti di frazionamento.

FRAZIONAMENTO IN BASE AL PUNTO ISOELETTRICO Si basa sulla minore solubilità delle molecole proteiche a valori di pH pari al loro punto isoelettrico A tale valore di pH una proteina possiede un numero uguale di cariche positive e negative, per cui risultano minimi gli effetti repulsivi e massime le interazioni intermolecolari, le quali determinano la formazioni di aggregati insolubili Tale proprietà può essere usata per precipitare selettivamente la proteina di interesse Ovviamente la proteina di interesse dovrebbe possedere un pI molto diverso da quello della maggior parte delle proteine contaminanti SVANTAGGIO: la proteina precipitata inevitabilmente si denatura Dunque sarebbe preferibile adoperare il metodo per rimuovere le proteine contaminanti, aggiustando il pH dell’estratto in modo tale da precipitare queste proteine e non la proteina in esame

FRAZIONAMENTO PER DENATURAZIONE Si basa sulle differenze nella sensibilità al calore La temperatura alla quale la proteina di interesse va incontro a denaturazione è determinata in un esperimento pilota su piccola scala Una volta determinata tale temperatura critica, le proteine contaminanti termolabili sono allontanate scaldando la miscela ad una temperatura di 5-10°C inferiore alla temperatura critica, per 15-30 minuti Le proteine denaturate con questo processo sono rimosse per centrifugazione La presenza del substrato, del prodotto o di un inibitore competitivo spesso stabilizzano un particolare enzima, per cui è possibile utilizzare anche temperature più alte