Istituto sperimentale per la cerealicoltura - Roma Fabrizio Quaranta, Gabriella Aureli Consiglio Nazionale delle Ricerche - ISPA - Bari Giuseppina Avantaggiato Sviluppo di micotossine nel mais da granella in relazione all’ambiente e alla tecnica colturale

MICOTOSSICOSI NEGLI ALLEVAMENTI BUFALINI E DI BOVINI DA LATTE: DALL’EMERGENZA ALLA PREVENZIONE Torreinpietra 10 Giugno 2004

Le micotossine: definizione e patogenicità Le micotossine sono prodotti del metabolismo secondario di alcuni funghi filamentosi, tra cui quelli appartenenti ai generi Aspergillus, Penicillium e Fusarium. Le micotossine causano intossicazioni alimentari (micotossicosi) che comprendono diverse affezioni, acute e croniche, che colpiscono gli animali (assunzione di mangimi contaminati) e l’uomo (consumo di alimenti contaminati). Non vi sono indicazioni di tossigenicità per i LIEVITI, il che porta ad escludere la formazione di micotossine nel corso dei numerosi processi fermentativi.

La pericolosità delle micotossine è legata al loro basso peso molecolare e alla loro struttura “piatta” che le fa agire come proiettili che colpiscono direttamente l’obiettivo. Sono molto stabili e difficilmente attaccabili da agenti chimici o fisici, come le alte temperature.

Nelle zone a clima temperato, le micotossine più diffuse nelle colture cerealicole, in particolare mais e frumento, sono le AFLATOSSINE (B e G), le FUMONISINE (FB), gli ZEARALENONI (ZEA) e i TRICOTECENI (DON e T-2).   Nei prodotti alimentari finiti (soprattutto lattiero caseari) le micotossine si trovano con facilità, ma non bisogna associare direttamente la loro presenza con il livello di allarme tossicologico. La disponibilità di tecniche analitiche sempre più raffinate ha portato infatti ad un abbassamento della soglia di rilevazione aumentando la frequenza di riscontri “positivi” spesso non associati a un rischio tossicologico concreto. Se infatti fino a qualche anno fa era venivano rilevate solo contaminazioni con valori molto elevati di micotossine, attualmente e’ possibile evidenziare bassi valori di contaminazione, quindi presenze più diffuse ma con concentrazioni molto più contenute.

Aflatossine (B e G) prodotte da Aspergillus flavus (B1 e B2) e A. parasiticus (B1, B2, G1 e G2); contaminanti di: mais, arachidi, cotone, noci, frumento sorgo, segale, riso, fagioli, girasole, frutta secca; epatotossiche, cancerogene, mutagene, teratogene; meccanismo di azione: interagisono direttamente con acidi nucleici (addotti dell’RNA), proteine e membrana ribosomiale; considerate fra le più potenti sostanze cancerogene; classificate dallo IARC come cancerogene di classe 1 (sicuramente cancerogene per l’uomo).

Zearalenone (ZEN) prodotto principalmente da Fusarium graminearum, F. culmorum e F. cerealis (agenti di fusariosi e marciume rosso della spiga di mais); contaminante molto diffuso nei cereali in genere e in particolare nel mais; patogenicità: non è dotato di tossicità acuta ma esplica attività ormono-simile. Negli animali causa sindrome estrogenica (iperestrismo dei suini) e ipofertilità (bovini e polli); nell’uomo è suggerito un ruolo nel cancro cervicale, correlato a numerosi casi di pubertà precoce; meccanismo di azione: nel citoplasma si lega ai recettori proteici degli ormoni estrogeni; cancerogenicità: di tipo specie-specifica e secondaria all’effetto ormonale.

Deossinivalenolo (DON o Vomitossina) tricotecene prodotto principalmente da Fusarium graminearum e F. culmorum ( agenti del marciume rosso della spiga di mais); contaminante di: cereali (frumento, mais, orzo, avena, riso) e prodotti derivati; è causa di sindrome emetica ed elevata immunotossicità, immunosoppressione, vomito, rifiuto del cibo, infiammazioni, emorragie, degenerazione del midollo osseo; grave negli allevamenti suini; meccanismo di azione: probabile interazione con ribosomi ed acidi nucleici; cancerogenicità: possibile, soprattutto come conseguenza dell’azione immunosoppressiva.

Fumonisine (FB1; FB2; FB3) Prodotte principalmente da Fusarium moniliforme, F. proliferatum e F. verticillioides (agenti sistematici della fusariosi del culmo e del marciume rosato della spiga in ambienti caldo aridi); contaminanti molto diffusi del mais; l’esposizione primaria avviene tramite il consumo di mais (cariossidi, insilato e prodotti derivati); patogenicità: non causano tossicità acuta ma provocano la leucoencefalomalacia (ELEM) dei cavalli e l’edema polmonare dei suini (PPE), suggerito un ruolo nell’insorgenza del cancro esofageo umano; cancerogene (non genotossiche); meccanismo di azione: inibizione dell’enzima ceramide-sintetasi> alterazione sintesi sfingolipidi > apoptosi > proliferazione cellulare > tumore.

Attività dell’acqua (Aw) L’attività dell’acqua, o acqua libera, rappresenta la quota di acqua, contenuta in un substrato, effettivamente utilizzabile per la crescita dei microrganismi; rappresenta la misura della pressione di vapore d’acqua prodotta dall’umidità presente in un prodotto igroscopico; viene definita come : Aw= p/ps p= pressione di vapore del substrato ps= pressione di vapore dell’acqua pura alla stessa temperatura del substrato; Il valore di Aw è compreso tra 0 e 1; Il limite di crescita per la maggior parte dei batteri si ha con Aw compreso tra 0.91e 0.95; per la maggior parte delle muffe tra 0.80 e 0.93. Condizioni di forte disidratazione (Aw<0.60) impediscono lo sviluppo dei microrganismi che permangono tuttavia in uno stato vitale quiescente.

Esigenze minime di umidità del substrato (contenuto e attività dell’acqua) per lo sviluppo dei funghi tossigeni (Lacey, 1989; Ominski et al., 1994; Bottalico, 1999). Specie fungina Micotossine prodotte %H2O Aw Aspergillus flavus e parasiticus Aflatossine 17.5-18.5 0.78-0.80 A. ochraceous Ocratossine 15.0-15.5 0.76-0.83 Penicillium verrucosum 17-20 0.81-0.83 Fusarium culmorum DON e Zearalenone 20-22 0.89 F. graminearum F. equiseti Zearalenone 0.92 F. sporotrichioides Tossina T-2 0.88 F. moniliforme Fumonisine e fusarine 0.87

Livelli massimi di contaminazione ammessi o proposti Micotossine Livelli massimi ppb(=μg/kg s.s.) Riferimenti normativi cereali grezzi mais grezzo latte Aflatossine   B1+B2+G1+G2 4 10 Reg. UE 2174/2003 B1 2 5 M1 0.05 Deossinivalenolo 750 proposta UE Fumonisine B1+B2+B3 2000-4000 US-FDA, 2000 B1+B2 1000 Svizzera-Uff. Fed. Salute Pubbl., 1997 Ocratossina A Reg. UE 472/2002 Zearalenone 100 Circ. Min.Sanità n.10 del 9/6/1999

IL MAIS In Italia rappresenta oltre il 50% della produzione dell’intero settore cerealicolo; nel 2003 è stato coltivato su oltre 1.150.000 ettari, pari al 30% della superficie investita a cereali. E’ la seconda coltura per importanza e diffusione ed è in continua espansione grazie anche alle politiche europee di incentivazione. La coltura presenta un elevato rischio di accumulo di micotossine in quanto spesso attaccata da numerose specie fungine in grado di produrre un ampio spettro di metaboliti tossici. Sono soprattutto le spighe ad essere colonizzate da funghi tossigeni, tra cui varie specie di Fusarium, che determinano essenzialmente due tipi di patologie: il marciume rosso e il marciume rosato della spiga.

MARCIUMI DELLA SPIGA Il marciume rosso è causato principalmente da F. graminearum e F. culmorum in condizioni di buona piovosità e temperature non elevate in estate o inizio autunno. Il fungo si sviluppa a partire dalla sommità della spiga diffondendo un micelio rosso che si estende lungo tutta la spiga. Questi miceti possono produrre deossinivalenolo e zearalenone. Al marciume rosato sono associati soprattutto F. verticillioides e F. proliferatum in condizioni di aridità estiva e alte temperature e comunque in situazioni colturali di stress. L’infezione, tipica delle fasi finali della maturazione, parte generalmente dalle sete e si diffonde con un micelio rosa sulle cariossidi. Questi tipi di patogeni sono facilmente veicolati da insetti quali Ostrinia e Sesamia. Agli agenti eziologici del marciume rosato è legata la possibilità di sviluppare le temibili fumonisine.

INFESTAZIONI DI INSETTI Gli attacchi di lepidotteri minatori (Ostrinia e Sesamia) rispettivamente nelle situazioni climatiche più fresche (semine primaverili al centro-nord) o più calde (semine ritardate o estive al centro-sud), possono aggravare la contaminazione e la diffusione dei funghi tossigeni. Le lesioni e le rosure provocate dalle larve sono infatti facili porte di ingresso per le spore fungine, che vengono anche veicolate all’interno delle piante e delle spighe con le gallerie scavate dalle larve.

INFESTAZIONI DI INSETTI L’associazione fra attacco di insetti e sviluppo di malattie fungine è stata ampiamente dimostrata. Spore vitali di Fusarium sono state trovate all’esterno, all’interno e negli escrementi di larve di Sesamia. Anche senza il trasporto diretto degli insetti, le spore dei funghi troverebbero nei tessuti danneggiati un substrato favorevole alla germinazione. Oltretutto lo stress fisiologico causato alle piante dagli attacchi entomatici le indebolisce e le predispone agli attacchi fungini. Bartelt nel 1999 ha dimostrato inoltre che F. verticillioides produce una miscela di aromi di alcool, esteri e altre sostanze volatili altamente attrattive per gli insetti.

INFESTAZIONI DI INSETTI Nelle colture intercalari in semina estiva (“secondi raccolti”), il fenomeno può assumere aspetti preoccupanti. Nella fase di maturazione che avviene in autunno infatti, alla forte carica di larve di Sesamia si associano elevati valori di umidità ambientale tipici della stagione.   Il ricorso a ibridi Bt geneticamente modificati riduce significativamente la fusariosi della spiga da F. verticillioides e il conseguente accumulo di fumonisine grazie alla riduzione della popolazione di insetti, ma non riduce le infezioni di altre specie di Fusarium come F. graminearum e F. culmorum che portano all’accumulo di deossinivalenolo e zearalenone.

L’eventuale sviluppo e diffusione di funghi tossigeni è legato a molteplici fattori di tipo ambientale climatico e agronomico Fattori agronomici Possono assumere una certa rilevanza quelli che contribuiscono a ridurre le condizioni di stress o di squilibrio della coltura: classe di maturità dell’ibrido adeguata all’ambiente pedoclimatico e che consenta di effettuare la raccolta a fine estate - inizio autunno; scelta di ibridi adatti alla semina anticipata (early vigor) e caratterizzati da brattee consistenti, coprenti la spiga, portamento non eretto della spiga a maturazione, granelli meno suscettibili per forma e durezza a rotture durante la trebbiatura; epoca di semina anticipata, per permettere alle fasi fisiologiche più delicate (fioritura e allegagione) di svolgersi in condizioni climatiche non particolarmente critiche;

Fattori agronomici fittezza delle piante adeguata alla prevedibile disponibilità idrica, optando per densità non elevate e ibridi a spiga “elastica”; livello di fertilizzazione non eccessivo, equilibrato tra i diversi elementi (in particolare N e K2O) e con apporti azotati possibilmente frazionati; assistenza idrica adeguata, in particolare nelle fasi più sensibili (fioritura, formazione e riempimento dei granelli);

Fattori agronomici riduzione della competizione delle malerbe, con diserbo efficace e rotazioni rinettanti. controllo insetti minatori utilizzando ibridi meno suscettibili, anticipando il ciclo biologico della coltura rispetto alla II e III generazione dei lepidotteri, ricorrendo ad eventuali trattamenti insetticidi previo attento bilancio costi/benefici; epoca di raccolta non troppo lontana dalla maturazione fisiologica, con umidità della granella preferibilmente intorno al 24%, in un periodo né troppo caldo (agosto) né troppo umido (oltre la seconda metà di ottobre); regolazione degli organi lavoranti della mietitrebbia per ridurre rotture e fessurazioni delle cariossidi e per allontanare polveri e altre parti leggere, dove è massima la concentrazione di micotossine.

EPOCA DI RACCOLTA L’epoca di raccolta e, in particolare, l’intervallo di tempo e le condizioni climatiche che intercorrono tra la maturazione fisiologica della granella e la mietitrebbiatura, sono di particolare importanza per l’eventuale contaminazione e sviluppo di funghi tossigeni.  Dopo la formazione dello “strato nero” (maturazione fisiologica) la granella, ormai isolata dalla pianta madre, diventa più vulnerabile all’attacco dei funghi e per tale motivo andrebbe raccolta al più presto. La raccolta a maturazione fisiologica (umidità superiore al 30%) non è proponibile sia per difficoltà di funzionamento delle macchine operatrici che per i successivi costi di essiccazione, incompatibili con la prevedibile redditività della coltura.

EPOCA DI RACCOLTA Si deve comunque ridurre la permanenza della coltura in campo, accettando di raccogliere la granella con un’umidità superiore a quella raggiungibile lasciando la coltura ad asciugare “in piedi”. La raccolta dovrebbe già avvenire quando la granella raggiunge un’umidità del 24% circa, in quanto non ancora adatta allo sviluppo dei patogeni fungini (15-18% per Aspergillus e 20-22% per i Fusarium). Ricorrendo a ibridi medio-precoci, specie se seminati anticipatamente, questo tenore di umidità è raggiungibile nella prima metà di settembre, generalmente in condizioni climatiche meno favorevoli allo sviluppo dei miceti.

POST-RACCOLTA Di particolare importanza risulta la fase di post-raccolta, soprattutto la tempestività e l’incisività dell’essiccamento artificiale della granella, in particolare se raccolta con un elevato tenore di umidità (24% e oltre). Già nella massa di granella umida appena raccolta si attivano processi ossidativi con aumento della temperatura e rapida proliferazione secondaria di funghi, proporzionale ai tempi di attesa dell’essiccazione, all’umidità della granella, alla percentuale di cariossidi rotte o danneggiate, alla temperatura esterna e alla “pesantezza” dei cumuli: con una temperatura esterna superiore a 26°C la permanenza in cumulo della granella umida in attesa dell’essiccazione non dovrebbe superare le 24 ore. Lo stoccaggio del prodotto essiccato deve avvenire con un’umidità di riferimento il più bassa possibile, preferibilmente 4% o leggermente superiore per ibridi a granella vitrea, caratterizzati da alto peso specifico, elevata durezza dell’endosperma e Aw più basso della media. Valori superiori, fino al 14.5%, sono accettabili solo negli impianti dove è previsto il raffreddamento delle masse.

In una prova su 25 ibridi precoci di mais in semina estiva svolta a Roma nel 2000 F. verticillioides e F. proliferatum sono stati ritrovati in tutte le spighe testate, comprese quelle visibilmente sane. Le spighe sane contenevano comunque livelli molto più bassi di fumonisine FB1 + FB2 rispetto a quelle danneggiate dagli insetti (media di 2.69 e 133.6 mg/kg, rispettivamente). Un numero significativo di spighe sane ha evidenziato livelli di fumonisine superiori a 1 mg/kg (=1 ppm =1000 ppb), indicando che l’infezione fungina è presente anche in assenza di sintomi evidenti.

Livelli differenti di danno da insetti sulle spighe sono stati osservati sui 25 ibridi di mais in prova (media delle spighe visibilmente danneggiate dal 12% al 57%).   Le concentrazioni medie di fumonisine (FB1 + FB2 ) nelle spighe danneggiate sono variate da un minimo di 27 massimo di 287 mg/kg, anche se con forti valori di deviazione standard.

ROMA 2000 - MAIS IN SEMINA ESTIVA CONTENUTO MEDIO DI FUMONISINE (mg/kg) SPIGHE FUMONISINEmg/kg SANE 0.01 – 20 DANNEGGIATE 27 - 287 Valori limite raccomandati da US-FDA per FB1+FB2+FB3 uso zootecnico: 1-50 mg/kg; alimentazione umana: 2-4 mg/kg Valori limite raccomandati da Uff. fed. svizzero salute pubblica per FB1+FB2 alimentazione umana: 1 mg/kg

Livelli estremamente alti di fumonisine sono stati trovati nelle spighe danneggiate da Sesamia, con un massimo di 694 mg/kg per una spiga di un ibrido vitreo e valori medi superiori a 100 mg/kg per oltre la metà degli ibridi testati. La maggior durezza delle cariossidi degli ibridi vitrei dovrebbe limitare la rosura delle larve, ma da questa prova non è emersa nessuna correlazione fra grado di vitrosità delle cariossidi e contenuto di fumonisine. Non è emersa correlazione neanche fra livello di fumonisine nelle spighe danneggiate e in quelle sane dello stesso ibrido. Una buona correlazione (r = 0.749) è emersa invece fra il livello di danno alle spighe e la contaminazione da fumonisine e questo potrebbe essere utilizzato come indicatore preliminare non solo per la presenza di Fusarium ma proprio per predire il livello di accumulo dei suoi più pericolosi metaboliti tossici.

IN 25 IBRIDI DI MAIS PRECOCI IN SEMINA ESTIVA Consiglio Nazionale delle Ricerche - ISPA - Bari Istituto sperimentale per la cerealicoltura - Roma CORRELAZIONE TRA % SPIGHE VISIBILMENTE DANNEGGIATE DA SESAMIA NONAGRIOIDES E PRESENZA DI FUMONISINE IN 25 IBRIDI DI MAIS PRECOCI IN SEMINA ESTIVA

Prove 2002 Roma e Torreinpietra

In due ambienti del Lazio (Roma e Torreinpietra) sono stati valutati 9 ibridi di mais da granella appartenenti a tre gruppi FAO di precocità (500, 400 e 300) testati con diversi livelli di input agronomici.

Climaticamente la stagione colturale 2002 è stata decisamente anomala: giugno senza piogge e con temperature particolarmente elevate che hanno determinato un grave stress poco prima della formazione degli organi fiorali. Di ciò hanno risentito soprattutto le semine anticipate che erano state impostate invece per limitare gli effetti del deficit idrico in questa fase fisiologica fondamentale. A Torreinpietra dove il terreno è caratterizzato da minor ritenzione idrica si è intervenuti con un’irrigazione di soccorso anche per i tre ibridi precoci; In luglio, e anche in agosto, si sono susseguite invece una serie di inattese ed abbondanti precipitazioni che di fatto hanno annullato (a Roma) o ridotto (a Torreinpietra) gli effetti delle due diverse tesi irrigue. Anche nella semina estiva l’andamento stagionale particolarmente piovoso, ha reso superflui il secondo e terzo intervento irriguo, ma, nello stesso tempo, ha anche creato difficoltà nelle fasi di maturazione e asciugamento della granella, facendo ritardare l’epoca di raccolta ed esponendo così la coltura ad una maggiore pressione degli agenti parassitari (insetti e funghi) in un periodo stagionale caratterizzato da elevata umidità ambientale.

La riduzione degli input al mais con la limitazione del sussidio idrico alle fasi fenologiche più critiche si è rivelata praticabile anche nell’areale di Torreinpietra dove si sono ottenuti risultati quanti-qualitativamente nel complesso accettabili, nonostante il terreno tendenzialmente sabbioso, e quindi con scarsa ritenzione idrica, la stagione molto arida nella prima parte del ciclo e lo scarso controllo delle malerbe.

Nelle prove del 2002 - per definire se le micotossine fossero già sviluppate durante la granigione della spiga o se l’infestazione fosse legata alle sole evenienze nella fase di post-maturazione e, quindi, per individuare il momento iniziale della eventuale contaminazione - è stato prelevato un campione di spighe in ogni parcella in tre momenti: maturazione latteo-cerosa (circa 20-25 giorni dopo la fioritura); maturazione fisiologica (circa 25 giorni dopo la lattea) quando cioè avviene la formazione dello “strato nero” sulla cariosside e si interrompono i rapporti biologici tra il seme (che inizia a perdere umidità) e la pianta madre; raccolta “commerciale”.

2002 I campioni previsti per le analisi erano 135 per ciascun prelievo ROMA semina anticipata: 9 ibridi x 2 tesi irrigue = 18 semina normale: 9 ibridi solo 1 tesi irrigua = 9 semina estiva 3 ibridi precoci solo 1 tesi irrigua = 3 TORREINPIETRA solo semina anticipata 6 ibridi x 2 tesi irrigue =12 3 ibridi precoci x 1 tesi irrigua = 3 Roma 30 + Torreinpietra 15 = 45 parcelle x 3 ripetizioni = 135 campioni x 3 momenti di prelievo = TOTALE 405 campioni.

Preparazione del campione Prelevamento random di 5 spighe da ciascuna parcella  refrigerazione a 4°C  sgranatura delle spighe fino ad ottenere almeno 300 grammi di granella  conservazione a –20°C  preparazione del campione analitico mediante scongelamento ed essiccazione in stufa ventilata a 50°C per almeno 20h  granella con umidità non superiore al 13%  doppia macinazione con 2 mulini da laboratorio per ottenere uno sfarinato molto fine  conservazione mediante refrigerazione a 4°C fino all’analisi.

2002 La sezione di merceologia dei prodotti ha effettuato sui campioni di granella il test di screening per la rilevazione di zearalenone e deossinivalenolo (DON), utilizzando il metodo immunoenzimatico (ELISA) di tipo competitivo. Per le caratteristiche di sensibilità e velocità di esecuzione, il test ELISA risulta idoneo per lo screening su un gran numero di campioni, consentendo la rapida individuazione di quelli contaminati. I limiti medi di quantificazione sui cereali dei kit ELISA sono 50 ppb per zearalenone e 18.5 ppb per DON.

2002 Sono stati analizzati inizialmente tutti i campioni prelevati alla raccolta “commerciale” (3° campionamento in campo). Quando questi campioni sono risultati positivi, il test ELISA è stato effettuato anche su quelli prelevati nella precedente fase di maturazione fisiologica (2° campionamento). Se anche questi campioni risultavano positivi l’analisi è stata effettuata anche per quelli prelevati nella precedente fase di maturazione latteo-cerosa (1° campionamento). Tutti i campioni positivi al test ELISA sono stati sottoposti all’analisi cromatografica (HPLC) del DON e dello ZEA presso l’ISPA di Bari.

125 relativi al 3° prelievo (raccolta “commerciale”) 2002 Sono stati analizzati con il test ELISA complessivamente 143 campioni di farina di mais : 125 relativi al 3° prelievo (raccolta “commerciale”) 83 di Roma e 42 di Torreinpietra. Di questi 125 campioni ne sono risultati positivi 16 14 di Roma (17%) e 2 di Torreinpietra (5%).

ROMA 2002 Test ELISA Prova Ibrido Tesi irrigua DON Zearalenone (max 750 ppb) (max 100 ppb) 3° prelievo (ppb) 2° prelievo Semina anticipata PR34B23 1 (=2) 60.6 Senegal 26.5 Moissac 45.5 89.5 18.6 % positivi (su 45) 9% 2% 0% Semina normale Orange >500 385.3 Dk 537 20.4 97.6 41.8 PR36B08 % positivi (su 27) 15% 7% Semina estiva 19.8 269.5 65.2 272.2 35.1 254.3 35.9 % positivi (su 11) 55% % positivi (su 83 totali) 17% 4% Test ELISA I limiti medi di quantificazione sui cereali dei kit ELISA sono 18.5 ppb per DON e 50 ppb per zearalenone. ROMA 2002

% positivi (su 125) 13% 2% TORREINPIETRA 2002 Roma e Torreinpietra Test ELISA TORREINPIETRA 2002 Prova Ibrido Tesi irrigua DON Zearalenone (max 750 ppb) (max 100 ppb) 3° prelievo (ppb) 2° prelievo Semina anticipata Senegal 1 154.0 Biaris 28.7 % positivi (su 42) 5% 0% Roma e Torreinpietra % positivi (su 125) 13% 2%

Dei 16 campioni risultati positivi alla raccolta “commerciale” (tutti e 16 al DON, 3 anche allo ZEA) solo 2 sono risultati positivi anche in fase fisiologica e solo al DON. Nessun campione prelevato alla maturazione latteo-cerosa è risultato positivo a conferma che i processi di sviluppo delle micotossine si verificano soprattutto durante le fasi di maturazione e asciugamento della granella e che tale periodo deve essere abbreviato, compatibilmente con i costi aggiuntivi necessari per un’essiccazione artificiale. Appare evidente la maggior contaminazione registrata a Roma rispetto a Torreinpietra, località costiera caratterizzata da clima più asciutto, ma dove il mais viene sottoposto a rotazioni colturali piuttosto strette. A Roma la contaminazione sembra aumentare con il ritardo dell’epoca di semina. Tra le due micotossine studiate con il test ELISA, il DON è risultata nettamente più presente rispetto allo zearalenone, anche per la maggiore sensibilità del metodo.

In semina primaverile gli ibridi precoci, in particolar modo Moissac e Orange, sono risultati più contaminati anche a causa della maggior permanenza in campo dopo la maturazione fisiologica. Nessuna contaminazione è stata registrata per gli ibridi di ciclo medio PR34F02 e Maverik. Considerando che a Roma le piogge hanno di fatto annullato le differenze tra le due tesi irrigue in semina anticipata, e che solo a Torreinpietra tale differenziazione si è potuta parzialmente realizzare, va notato che le uniche 2 parcelle contaminate in quest’ultima località appartenevano alla tesi 1, maggiormente stressata.

Tenendo conto di questi limiti Nella valutazione dei risultati, infine, è opportuno considerare comunque le indicazioni circa i livelli massimi di contaminazione ammessi o suggeriti per i cereali grezzi: deossinivalenolo: 750 ppb (limite proposto in ambito UE); zearalenone: 100 ppb (limite suggerito dall’Istituto Superiore di Sanità).   Tenendo conto di questi limiti solo 3 campioni risulterebbero superiori per il DON 1 per lo zearalenone.

Consiglio Nazionale delle Ricerche - ISPA - Bari Istituto sperimentale per la cerealicoltura - Roma ISPA - BARI Tutti i campioni positivi al test ELISA sono stati sottoposti all’analisi cromatografica (HPLC) per DON e Zearalenone. Tutti i campioni raccolti sono stati sottoposti, sempre con il metodo HPLC, a dosaggio delle fumonisine FB1+FB2

Limiti di sensibilità del test ELISA: ZEA = 50 ppb DON =18.5 ppb   Limiti di sensibilità del metodo HPLC: ZEA = 3 ppb DON= 50 ppb (vecchio DAD), 5-10 ppb (nuovo DAD) FBs = 12 ppb

Prelievo alla raccolta “commerciale” (3° prelievo) Dei 16 campioni risultati positivi al DON con il test ELISA, hanno confermato la positività anche con HPLC solo i 7 con i valori più elevati. Tutti e 3 i campioni positivi allo Zearalenone con il test ELISA sono risultati positivi anche con HPLC, con livelli di contaminazione analoghi Prelievo alla maturazione fisiologica (2° prelievo) Dei 2 campioni positivi al DON con il test ELISA nessuno è risultato positivo con HPLC.

Dosaggio delle fumonisine FB1+FB2 Esiste ancora un grande margine di incertezza sui valori accettabili dei livelli di esposizione individuale per uomini e animali alle fumonisine; Per il mais intero o parzialmente degerminato è stato indicato un valore limite di 4 ppm (come somma delle fumonisine) dall’U.S. Food and Drug Administration e di 1 ppm dall’Ufficio Federale per la Salute Pubblica della Svizzera.

Campioni con valori superiori a Località Epoca di semina Prelievo Campioni analizzati Valore medio FB1+FB2 Campioni con valori superiori a 4 ppm 1 ppm n. ppm % Torreinpietra anticipata 3° 42 1.31 14 21 2° 0.10 2 Roma 45 4.50 33 62 0.22 4 normale 27 10.9 48 81 0.34 15 estiva 11 17.0 73 100 2002

A Roma la semina normale, favorita rispetto alla anticipata dal particolare andamento termopluviometrico della stagione 2002 e che si presentava alla raccolta in ottime condizioni, ha fatto registrare percentuali più alte di contaminazione rispetto alla semina anticipata (48% dei campioni con somma dei valori di FB1 e FB2 superiore a 4 ppm contro 33%), forse anche a causa del ritardo di circa 20 giorni (molti piovosi) nella raccolta.   Nella semina estiva si è confermata la gravità della contaminazione da fumonisine (73% dei campioni con somma dei valori di FB1 e FB2 superiore a 4 ppm e 100% superiori a 1 ppm), legata alla presenza di Sesamia e al clima umido di pieno autunno in cui avviene la fase finale della maturazione della granella.

A Torreinpietra, malgrado il mais sia andato incontro ad un maggior stress idrico, il clima sicuramente più asciutto ha determinato una contaminazione inferiore, anche se sempre preoccupante (14% dei campioni con somma dei valori di FB1 e FB2 superiore a 4 ppm nel prelievo alla raccolta “commerciale”).

Prove 2002 Tra gli ibridi, solo PR34B23 (classe FAO 500) ha manifestato una minore suscettibilità in entrambe le località ed epoche di semina. Non sembrano risultare differenze significative fra tesi irrigue, per quanto scarsamente differenziate da un punto di vista agronomico a causa delle abbondanti precipitazioni della stagione di prova.

Prove 2003 Roma

2003 A Roma sono stati valutati 9 ibridi di mais da granella appartenenti a tre gruppi FAO di precocità (500, 400 e 300) testati con diversi livelli di input agronomici.

Sulla base dei risultati 2002, nelle prove del 2003 si è ritenuto opportuno non effettuare il prelievo a maturazione latteo-cerosa e monitorare invece con più efficacia la fase dopo la maturazione fisiologica effettuando i seguenti tre prelievi: maturazione fisiologica; 20 giorni dopo; 40 giorni dopo.

L’andamento climatico della stagione colturale 2003 è stato decisamente anomalo, caratterizzato da temperature sempre molto più elevate della media già in fase vegetativa e con il susseguirsi prolungato di valori massimi molto alti che hanno determinato gravi stress fisiologici alle piante e un rapido disseccamento della granella. Non sono state registrate piogge utili fino al 31 agosto.

A causa della prolungata aridità i tre ibridi precoci in asciutto hanno avuto fioriture molto difficoltose con scarsissima allegagione. Le troppe parcelle con piante prive di spiga hanno di fatto obbligato a scartare queste tesi. L’ibrido precoce Moissac ha avuto nascite rade in tutte e tre le epoche di semina e i dati riportati vanno pertanto valutati con cautela

Test ELISA I limiti medi di quantificazione sui cereali dei kit ELISA sono 18.5 ppb per DON e 50 ppb per zearalenone. Prova Ibrido Interventi irrigui (n.) DON Zearalenone (max 750 ppb) (max 100 ppb) 3° prelievo mat. fisio+40g (ppb) Semina anticipata PR34F02 1 18.6 % positivi (su 53) 1.8% 0% Semina normale 2 % positivi (su 23) Semina estiva Moissac 3 102.1 % positivi (su 12) 8% % positivi (su 93 totali) 1.1% ROMA 2003 Le analisi sui corrispondenti campioni prelevati 20 e 40 giorni prima (2° e 1° prelievo) non hanno evidenziato risposte positive, a conferma che i processi di sviluppo delle micotossine avvengono soprattutto durante le fasi avanzate di maturazione e asciugamento della granella.

L’unico campione risultato positivo allo ZEA con test ELISA ha confermato la positività anche con HPLC con valori abbastanza simili (124.7 ppb) e superiori al limite suggerito dall’Istituto Superiore di Sanità (100 ppb). Anche l’unico campione risultato positivo al DON con test ELISA ha confermato la positività anche con HPLC con valori simili (10 ppb), decisamente più bassi del limite proposto in ambito UE (750 ppb). Va comunque segnalato che ad un controllo di 7 negativi al DON con test ELISA ben 3 sono risultati positivi con HPLC con valori da 24 a 36 ppb, sempre molto lontani dai limiti di sicurezza.

Dosaggio delle fumonisine FB1+FB2 Consiglio Nazionale delle Ricerche - ISPA - Bari Istituto sperimentale per la cerealicoltura - Roma Dosaggio delle fumonisine FB1+FB2 Metodo HPLC

104.13

Campioni con valori superiori a Località Epoca di semina Interventi irrigui Prelievo Campioni analizzati Valore medio FB1+FB2 Campioni con valori superiori a 4 ppm 1 ppm n. ppm % Roma anticipata 1 3° 26 0.1 2 27 0.9 7 19 53 0.5 4 9 normale 23 0.7 estiva 3 11 39.5 91 2° 8.0 100 1° 12 8.9 50 75 2003 1° prelievo: maturazione fisiologica 2° prelievo: 20 giorni dopo mat. fisio 3° prelievo: 40 giorni dopo mat. fisio

2003 Per le semine primaverili, anticipata e normale, si sono registrate quest’anno basse percentuali di contaminazione da fumonisine: solo l’ibrido Senegal in entrambe le epoche di semina ha avuto 1 campione con somma dei valori di FB1+FB2 superiori a 4 ppm. Molto grave è risultata la contaminazione per la semina estiva con valori molto elevati di FB1+FB2 anche nel secondo e primo prelievo.

Per quanto riguarda l’effetto delle tesi irrigue in semina anticipata, va evidenziato che con la tesi 1 che prevedeva un solo intervento irriguo (all’emissione del pennacchio) sono stati registrati valori di FB1+FB2 molto bassi, mai superiori a 0.25 ppm mentre con la tesi 2, che prevedeva una seconda irrigazione nella fase di riempimento, si sono avuti cinque campioni con livelli di contaminazione superiori a 1 ppm, due dei quali superiori a 4 ppm.

Moissac, tra i precoci, e Senegal, tra i medi, sembrano gli ibridi più sensibili alle contaminazioni da fumonisine. Bassissimi livelli hanno fatto registrare, viceversa, gli ibridi medi PR34F02 e PR34B23, in particolare quest’ultimo ha confermato la minore suscettibilità gia evidenziata nel 2002, in condizioni climatiche completamente diverse.

In conclusione nel 2003, caratterizzato da caldo e siccità prolungati, si è avuta una minore contaminazione di micotossine, soprattutto DON e ZEA, ma anche Fumonisine, rispetto al 2002 quando l’estate fu inaspettatamente piovosa e furono registrati valori allarmanti di tutte le micotossine analizzate.

Le particolari condizioni climatiche del 2003 hanno però favorito in molte aree maidicole lo sviluppo in campo delle Aflatossine, in genere temibili solo nelle fasi di immagazzinamento e conservazione. Si è ritenuto quindi opportuno analizzare i campioni prelevati anche per il riscontro della presenza dei metaboliti tossici degli Aspergillus, ma nessuno dei campioni analizzati è risultato finora positivo. Si ipotizza che la presenza di Fusarium funzioni da antagonista e inibitore per altre specie fungine, tra cui Aspergillus

Si ringrazia la Dott.ssa Andreina Belocchi per la preziosa collaborazione fornita nella stesura della presentazione Si ringraziano i p.a. Valerio Mazzon e Andrea Serarcangeli per la conduzione delle prove in campo