MAPPATURA GENETICA Costruzione di mappe in cui viene riportata la posizione relativa dei geni e la distanza tra di essi, vengono costruite attraverso la stima delle frequenze di ricombinazione

Insieme dei gameti prodotti da x Vengono definiti Parentali (P) i gameti prodotti da un individuo x che hanno la stessa combinazione allelica di quelli attraverso i quali l’individuo x ha avuto origine, vengono invece definiti Ricombinanti (R) i gameti con una combinazione allelica diversa da quella dei gameti da cui x ha avuto origine A, b a, B Aa Bb Zigote x Individuo x adulto Insieme dei gameti prodotti da x Ab aB AB ab Gameti P Gameti R

se i 2 loci sono indipendenti Riferendoci all’individuo della precedente diapositiva, ci aspettiamo che: A, b a, B Aa Bb Zigote x se i 2 loci sono indipendenti no.gameti aB = no.gameti Ab = no.gameti ab = no.gameti AB no. gameti P (aB + Ab) = no. gameti R (ab + AB) se i 2 loci sono associati no.gameti aB = gameti Ab > no.gameti ab = no.gameti AB no. gameti P (aB + Ab) > no. gameti R (ab + AB)

IMPORTANTE!!! La classificazione dei gameti in Parentali e Ricombinanti è possibile anche quando i geni si trovano su cromosomi diversi

Se i 2 loci si trovano su cromosomi diversi la probabilità che si formi un gamete Parentale è uguale alla probabilità che si formi un gamete Ricombinante A a B b 1 1 2 2 A B a b A b a B 1 2 1 2 1 2 1 2 Gameti P Gameti R

B b Se i 2 loci si trovano adiacenti sullo stesso cromosoma e talmente vicini da non ricombinare mai la probabilità che si formi un gamete Parentale è 1 e la probabilità che si formi un gamete Ricombinante è 0 B A b A a a B b B A b A a a solo gameti P (prodotti da un doppio eterozigote in fase cis) solo gameti P (prodotti da un doppio eterozigote in fase trans)

A b a B Se i 2 loci si trovano adiacenti sullo stesso cromosoma ma a una distanza tale che è possibile il verificarsi di crossing over la probabilità che si formi un gamete P è > 0.5 e la probabilità che si formi un gamete R è < 0.5 A B a b a b A b a B A B A B a b A b a B gameti R (da un doppio eterozigote in fase trans) gameti P (da un doppio eterozigote in fase trans) gameti R (da un doppio eterozigote in fase cis) gameti P (da un doppio eterozigote in fase cis)

MAPPATURA GENETICA La costruzione di mappe genetiche è possibile perché: i geni sono disposti linearmente lungo il cromosoma il loro ordine è lo stesso in tutti gli individui della stessa specie la probabilità che tra due loci avvenga un crossing over dipende (anche) dalla distanza che li separa

La probabilità che tra due loci avvenga un crossing-over è tanto più elevata tanto più i loci sono distanti

Come possiamo sapere quante volte tra due loci, A e B, avviene un crossing over? Un crossing-over può essere evidenziato solo nelle meiosi di individui doppi eterozigoti (= eterozigoti sia al locus A che al locus B), quindi il requisito minimo per mappare due geni l’uno rispetto all’altro è che di ENTRAMBI si conoscano almeno due alleli: è possibile mappare i loci A e B l’uno rispetto all’altro solo se locus A  alleli A1 e A2 locus B  alleli B1 e B2

La costruzione di mappe genetiche è relativamente facile per gli organismi modello in cui sia possibile: 1. Programmare gli incroci 2. Ottenere una progenie numerosa

(corpo grigio e ali normali) (corpo nero e ali vestigiali) Consideriamo i due loci di Drosophila melanogaster che controllano il colore del corpo (B = allele selvatico, corpo grigio; b = corpo di colore nero) e la forma delle ali (VG = allele selvatico, ali normali; vg = ali vestigiali) BB VGVG tipo selvatico (corpo grigio e ali normali) bb vgvg doppio mutante (corpo nero e ali vestigiali) P Tutti con corpo grigio e ali normali nati dall’unione di un oocita (B,VG) con uno spermatozoo (b,vg)

Tutti con corpo grigio e ali normali nati dall’unione di un oocita (B,VG) con uno spermatozoo (b,vg) Questi moscerini producono 4 tipi di gameti Gameti P  (B, VG) e (b, vg) Gameti R  (B, vg) e (b, VG)

(corpo grigio e ali normali) (corpo nero e ali vestigiali) Incrociamo un Bb VGvg con un doppio recessivo (test cross) Bb VGvg (BVG/bvg) tipo selvatico (corpo grigio e ali normali) bb vgvg doppio mutante (corpo nero e ali vestigiali) Risultato atteso Bb VGvg Selvatico Bb vgvg Corpo selvatico ali vestigiali bb VGvg Corpo mutante ali normali bb vgvg Doppio mutante totali se loci indipendenti 25% 100% se loci associati >25% <25% osservato 397 (33,1%) 216 (18,0%) 198 (16,5%) 389 (32,4%) 1200 (100%) CONCLUSIONE: i 2 loci sono associati R = (216+198)/1200 = 0.345 (B VG) e (b vg)  gameti parentali, (B vg) e (b VG)  gameti ricombinanti (b vg)  gameti prodotti dal doppio mutante

Aa Bb aa bb Se i 2 loci sono indipendenti la Probabilità di ottenere questa fratria (6 gameti Parentali su un totale di 6 meiosi informative) è (1/2)6 = 0.0156

Tipo di fratria Probabilità di ottenerla se loci indipendenti 6 P 5 P e 1 R 4 P e 2 R 3 P e 3 R 2 P e 4 R 1 P e 5 R 6 R (1/2)6 = 0,0156 [6!/(1!5!)]*0,0156 = 0,0936 [6!/(2!4!)]*0,0156 = 0,234 [6!/(3!3!)]*0,0156 = 0,312 [6!/(4!2!)]*0,0156 = 0,234 [6!/(5!1!)]*0,0156 = 0,0936

MAPPATURA GENETICA NELL’UOMO METODO DEI LOD SCORE (Morton 1955) E’ in grado di distinguere tra associazione e indipendenza Non dipende dalla fase degli alleli del doppio eterozigote (cis o trans) né dalla sua conoscenza Permette di combinare dati provenienti da famiglie diverse In caso di associazione non assoluta è in grado di stimare la frazione di ricombinazione ad es. in drosofila e nei batteri si possono ottenere progenie molto numerose su cui confrontare attesi ed osservati in caso di associazione o di indipendenza. La percentuale di ricombinanti se calcolata su grandi numeri dà una buona stima della frequenza di ricombinazione

METODO DI MASSIMA VEROSIMIGLIANZA (ML = Maximum Likelihood) Data un’ipotesi A e un certo risultato R la verosimiglianza di A viene calcolata come probabilità che si verifichi R nel caso in cui A sia vera

Secondo i metodi di massima verosimiglianza (Maximum Likelihood, ML) quando ci si trova di fronte a un risultato (R) e a una serie di ipotesi tutte compatibili con esso: si valuta la verosimiglianza di ciascuna ipotesi si ottiene così una distribuzione di verosimiglianze (definite a posteriori perché ottenute sulla base del risultato R) se una delle ipotesi risulta molto più verosimile (quanto?) delle altre, la si considera l’ipotesi giusta

Talvolta, oltre al risultato R, si dispone di informazioni indipendenti che possono essere utilizzate per assegnare a ciascuna ipotesi una verosimiglianza a priori (cioè indipendente da R) Il confronto tra le varie ipotesi avverrà sulla base delle verosimiglianze globali (= verosimiglianza a priori x verosimiglianza a posteriori)

Esempio 1: abbiamo un sacchetto contenente, in ugual numero, 3 tipi di monete : monete con testa su entrambe le facce (TT) monete con croce su entrambe le facce (CC) monete con croce su una faccia e testa sull’altra (CT) Dobbiamo stabilire che tipo di moneta viene estratta senza poterla guardare ma effettuando una serie di 4 lanci

Ma quanto più verosimile? Risultato dei 4 lanci Probabilità per monete TT TC CC 4 T 3 T e 1 C 2 T e 2 C 1 T e 3 C 4 C 1 1/16 0 0 4/16 0 0 6/16 0 0 1/16 1 Risultato ottenuto (R) = 4 T  possiamo scartare l’ipotesi CC, l’ipotesi TT è più verosimile dell’ipotesi TC Ma quanto più verosimile? Dato il risultato R (4 T): Verosimiglianza di TT 1 Verosimiglianza di TC 1/16 Verosimiglianza di CC 0 L’ipotesi TT è 16 volte più verosimile dell’ipotesi TC

Il rapporto di verosimiglianze TT:TC è a priori 1:1 (il no. di monete TT nel sacchetto è uguale al no. di monete TC) a posteriori 16:1 (il risultato ottenuto, 4 T, è 16 volte più verosimile se la moneta è TT piuttosto che TC) Questo metodo si può applicare anche quando il rapporto tra le verosimiglianze a priori è diverso da 1:1

Esempio  se le monete TT sono 20 volte più numerose delle TC La VEROSIMIGLIANZA a priori A FAVORE di TT è 20:1 La VEROSIMIGLIANZA a posteriori A FAVORE di TT è 16:1 La VEROSIMIGLIANZA GLOBALE A FAVORE di TT è (20 x 16) : 1, cioè 320 : 1

Se, viceversa, le TT sono 20 volte meno numerose delle TC la verosimiglianza diventa: a priori 1(TT):20(TC) a posteriori 16(TT):1(TC) globale 16(TT):20(TC) cioè l’ipotesi che la moneta sia TC è più verosimile rispetto all’ipotesi che sia TT, ma solo di poco (rapporto tra le due verosimiglianze 1:1.25)

Esempio 2: abbiamo un sacchetto con vari tipi di monete: 90% sono monete ‘perfette’ (uguale probabilità di dare Testa o Croce) 10% sono monete ‘viziate’ (la probabilità di T è minore della probabilità di C). Queste monete differiscono tra di loro per la probabilità di dare T, per alcune P(T) = 0.4, per altre P(T) = 0.3 ecc. Prendiamo a caso una moneta, dobbiamo stabilire se essa sia del tipo P(T) = 0.5 o P(T) < 0.5 Sulla base della numerosità tenderemo a preferire l’ipotesi P(T) = 0.5 (sono il 90%). Il risultato di una serie di n lanci potrebbe però modificare questa preferenza

Immaginiamo di aver effettuato 6 lanci e di aver ottenuto 1T e 5C; la verosimiglianza di questo risultato cambia a seconda del tipo di moneta Tipo di moneta PT V a posteriori 1 T, 5 C   VPT/VPT = 0.5 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0937 0.1866 0.3025 0.3932 0.3543 1 1.99 3.23 4.19 3.78 -  la verosimiglianza del risultato 1 T e 5 C in una serie di 6 lanci viene calcolata con la formula di Bernoulli, dove n è il no. totale di lanci, k il no. di T ottenute, p la probabilità di ottenere T e (1-p) quella di ottenere C Possiamo scartare l’ipotesi che la moneta sia del tipo P(T) = 0, l’ipotesi più verosimile è che sia una moneta con P(T) = 0.2, ma anche le altre ipotesi hanno verosimiglianze piuttosto elevate Nessuna delle ipotesi è molto più verosimile di una qualsiasi delle altre

Possiamo valutare la verosimiglianza a favore/sfavore dell’ipotesi moneta-perfetta prima e dopo la serie di 6 lanci V. a priori 9:1 a favore (le monete perfette sono 9 volte più abbondanti delle monete viziate) V. a posteriori a favore dell’ipotesi moneta P(T) = 0.2 (ma solo di 4 volte rispetto all’ipotesi P(T) = 0.5) V. globale 9:4 a favore di P(T) = 0.5

Quanto deve essere la verosimiglianza a favore di un’ipotesi per accettarla come vera? Prima di iniziare l’esperimento si decide una soglia che risulta un compromesso tra due esigenze opposte: 1) ridurre al minimo i casi in cui si accetta per buona un’ipotesi che invece è sbagliata; 2) ridurre al minimo i casi in cui si lascia senza risposta il problema in esame Il valore della soglia dipende soprattutto da quanto gravi sarebbero le conseguenze di una decisione errata

Quello appena illustrato è il principio su cui si basa il metodo dei LOD score La P(T) della moneta è equivalente alla frequenza di ricombinazione tra i due loci in esame: le monete con P(T) = 0.5 sono le coppie di loci indipendenti, le monete con P(T) < 0.5 sono le coppie di loci associati Ogni lancio corrisponde a una meiosi informativa (cioè a un figlio classificato con certezza come originato da un gamete P o R)

Il metodo dei LOD SCORE ci consente di mappare due loci A e B l’uno rispetto all’altro, cioè ci consente di rispondere alla domanda: A e B sono indipendenti? cioè θ = (1 – θ) = 0.5 (moneta perfetta) oppure A e B sono associati? cioè θ < 0.5 (moneta viziata) questa ipotesi è costituita da n ipotesi, una per ciascuno degli n valori compresi tra 0 e 0.5 (le monete viziate non sono tutte uguali)

PROBLEMA: dove si trova il gene responsabile della malattia genetica M che è una malattia mendeliana a trasmissione Autosomica Dominante? Cerco di stabilire se esso sia vicino al locus del marcatore A (un marcatore STR di cui si conoscono vari alleli e di cui è nota la localizzazione cromosomica) Se dimostro che il locus malattia M e il locus marcatore A sono vicini ho individuato la regione cromosomica in cui si trova il locus M

MAPPATURA di un LOCUS MALATTIA RISPETTO ad un LOCUS MARCATORE con il METODO DEI LOD SCORE, esempio di mappatura di una malattia a trasmissione Autosomica Dominante reperimento delle famiglie in cui segrega la malattia; costruzione dei pedigree e assegnazione del fenotipo (malato o sano) a ciascun membro della famiglia; determinazione del genotipo di tutti gli individui per il marcatore e verifica dell’informatività delle famiglie (il genitore che trasmette la malattia deve essere eterozigote per il locus marcatore); per ciascuna famiglia conta dei gameti parentali e dei gameti ricombinanti; calcolo dei LOD score per ciascuna famiglia; somma dei LOD score ottenuti sulle singole famiglie; costruzione del grafico dei LOD score

METODO DEI LOD SCORE: 3) Verifica dell’informatività delle famiglie La condizione minima è che il GENITORE CHE TRASMETTE LA MALATTIA (e che quindi è eterozigote al locus-malattia) SIA ETEROZIGOTE ANCHE AL LOCUS MARCATORE

Queste famiglie non sono mai informative MEIOSI INFORMATIVE E NON INFORMATIVE Locus di una malattia Autosomica Dominante, Locus del marcatore A individuo sano (dd) individuo malato (Dd) A) NON INFORMATIVA Il padre, II-1, che ha trasmesso la malattia alla figlia III-1, è omozigote per il locus marcatore: i suoi alleli a questo locus non possono essere distinti Queste famiglie non sono mai informative

MEIOSI INFORMATIVE E NON INFORMATIVE B) NON INFORMATIVA La figlia ha ereditato dal padre l’allele malattia, ma può averlo ereditato insieme ad A1 OPPURE insieme ad A2 (cioè, non possiamo classificare lo spermatozoo che ha dato origine a III-1 come Parentale o come Ricombinante) C) INFORMATIVA La figlia ha ereditato dal padre l’allele malattia INSIEME all’allele A1 del marcatore (cioè, lo spermatozoo che ha dato origine a III-1 era Parentale) I genitori delle famiglie B) e C) sono uguali, ma la famiglia B) NON è informativa, mentre la C) lo è

Queste famiglie sono SEMPRE informative MEIOSI INFORMATIVE E NON INFORMATIVE D) INFORMATIVA La figlia ha ereditato dal padre l’allele malattia INSIEME all’allele A2 del marcatore (cioè, lo spermatozoo che ha dato origine a III-1 era Ricombinante) Queste famiglie sono SEMPRE informative

4. conta dei gameti parentali e dei gameti ricombinanti; METODO DEI LOD SCORE 4. conta dei gameti parentali e dei gameti ricombinanti; Gameti P = 5 Gameti R = 1 P R

Per poter classificare senza ambiguità un gamete come parentale o ricombinante è necessario avere informazioni su 3 generazioni II-1 ha ricevuto dalla madre l’allele patologico del locus malattia E l’allele A1 del locus marcatore: i suoi gameti P sono quelli con le combinazioni (A1+allele Malattia) e (A2+allele normale) P R II-1 ha ricevuto dalla madre l’allele malattia ma non sappiamo se lo abbia ricevuto insieme all’allele A1 o all’allele A2 del marcatore Non sappiamo quali siano i suoi gameti P e quali gli R

4) Calcolo dei LOD SCORE per le singole famiglie METODO DEI LOD SCORE: 4) Calcolo dei LOD SCORE per le singole famiglie sulla base del risultato osservato si calcola la verosimiglianza dell’ipotesi di indipendenza e quella di una serie di ipotesi di linkage (con valori di ricombinazione i ). Questo calcolo viene fatto utilizzando la formula di Bernoulli per ciascuna ipotesi di linkage si calcola l’ODD ratio (= V dell’ipotesi i / V dell’ipotesi di indipendenza); si calcola il Logaritmo di ciascun ODD (= LOD)

Risultato osservato  5 gameti P e 1 gamete R sulla base del risultato osservato si calcola la verosimiglianza dell’ipotesi di indipendenza e quella di una serie di ipotesi di linkage (con valori di ricombinazione i ). Questo calcolo viene fatto utilizzando la formula di Bernoulli Risultato osservato  5 gameti P e 1 gamete R Formula di Bernoulli   n = no. totale gameti informativi (6), k = no. gameti ricombinanti (1)  

Esempio di calcolo per la famiglia del pedigree (a fase nota)   IPOTESI VEROSIMIGLIANZA ODD LOD I 2 loci sono indipendenti I due loci sono associati con q = 0.4 I due loci sono associati con q = 0.3 I due loci sono associati con q = 0.2 I due loci sono associati con q = 0.1 I due loci sono associati con q = 0.05 I due loci sono associati con q = 0 (associazione assoluta) 0.56 = 0.015625 0.41 x (1-0.4)5 = 0.031104 0.31 x (1-0.3)5 = 0.050421 0.21 x (1-0.2)5 = 0.065536 0.11 x (1-0.1)5 = 0.059049 0.051 x (1-0.05)5 = 0.038689 01 x (1-0)5 = 0 0.015625/0.015625 = 1 0.031104/0.015625 = 1.991 0.050421/0.015625 = 3.227 0.065536/0.015625 = 4.194 0.059049/0.015625 = 3.779 0.038689/0.015625 = 2.4761 0/0.015625 = 0 0.299 0.509 0.623 0.577 0.394 - infinito

b) Per ciascuna ipotesi di linkage si calcola l’ODD ratio c) Si calcola il logaritmo di ciascun ODD (LOD) IPOTESI VEROSIMIGLIANZA ODD LOD I 2 loci sono indipendenti I due loci sono associati con q = 0.4 I due loci sono associati con q = 0.3 I due loci sono associati con q = 0.2 I due loci sono associati con q = 0.1 I due loci sono associati con q = 0.05 I due loci sono associati con q = 0 (associazione assoluta) 0.56 = 0.015625 0.41 x (1-0.4)5 = 0.031104 0.31 x (1-0.3)5 = 0.050421 0.21 x (1-0.2)5 = 0.065536 0.11 x (1-0.1)5 = 0.059049 0.051 x (1-0.05)5 = 0.038689 01 x (1-0)5 = 0 0.015625/0.015625 = 1 0.031104/0.015625 = 1.991 0.050421/0.015625 = 3.227 0.065536/0.015625 = 4.194 0.059049/0.015625 = 3.779 0.038689/0.015625 = 2.4761 0/0.015625 = 0 0.299 0.509 0.623 0.577 0.394 - infinito

[(1- θ)5θ1] 0.56 Risultato non conclusivo Esempio di calcolo per la famiglia del pedigree (a fase nota) [(1- θ)5θ1] 0.56 q 0.05 0.1 0.167 0.2 0.3 0.4 0.5 ODD 2.476 3.799 4.287 4.194 3.227 1.991 1 LOD Z Infinito 0.394 0.577 0.632 0.623 0.509 0.299 Risultato non conclusivo LOD ricombinazione

½ [(1- θ)5 θ 1] + ½ [(1- θ)1 θ 5] Esempio di calcolo per la famiglia del pedigree (a fase NON nota) ½ [(1- θ)5 θ 1] + ½ [(1- θ)1 θ 5] 0.56 q 0.05 0.1 0.167 0.2 0.3 0.4 0.5 ODD 1.238 1.889 2.147 2.105 1.668 1.192 1 LOD Z Infinito 0.093 0.276 0.331 0.323 0.222 0.076 LOD ricombinazione

Risultato non conclusivo Bisogna cercare e studiare altre famiglie in cui sia presente la stessa malattia I LOD SCORE ottenuti sulle singole famiglie possono essere sommati

LOD  + 3  Ipotesi di linkage accettata VALORI di LOD CRITICI (valori soglia) LOD  + 3  Ipotesi di linkage accettata verosimiglianza a posteriori a favore del linkage 1000:1 verosimiglianza a priori che due loci siano linked (a sfavore dell’associazione) 1:50 verosimiglianza globale a favore dell’associazione 1000:50 (=20:1) (P = 0.05) LOD  - 2  Ipotesi di linkage scartata verosimiglianza a posteriori a favore dell’indipendenza 100:1 verosimiglianza a priori a favore dell’indipendenza 50:1 verosimiglianza globale a favore dell’indipendenza 5000:1 In studi sull’intero genoma la soglia di significatività deve essere più elevata

Esempi di curve di lod score Evidenza di linkage per θ = 0.23 Evidenza di linkage assoluto (θ = 0) Linkage escluso per valori di θ < 0.12 Risultato non conclusivo per tutti i valori di θ 1 linkage assoluto; 2 linkage per valori di ricombinazione 0.23; 3 linkage escluso per teta < 0.12; 4 non informativo

Ambito di incertezza della stima di θ

Metodo dei LOD SCORE  efficienza Teoricamente è in grado di scoprire qualsiasi grado di linkage, ma in pratica non è così  per scoprire gradi di associazione modesti (= elevata frequenza di ricombinazione) è necessaria una quantità di dati non realisticamente ottenibile Efficienza massima per linkage assoluti  se non ci sono ricombinanti 10 gameti informativi sono sufficienti a fornire prova di linkage Con 25 gameti informativi si può arrivare a dimostrare che due loci sono linked solo se la frequenza di ricombinazione tra di essi non supera il 10%. Se  = 0.2 sono necessari 36 gameti informativi; se  = 0.3 ne sono necessari 85 Con la mappatura genetica si può restringere la regione in cui si trova un gene malattia a qualcosa dell’ordine di 1-2 cM (equivalenti a 1-2 Mb)

L’associazione è tra loci e NON tra alleli ATTENZIONE !!! L’associazione è tra loci e NON tra alleli La stessa malattia NON è associata in tutte le famiglie allo stesso allele del marcatore Nelle due famiglie segrega la stessa malattia genetica, ma nella famiglia 1 l’allele malattia ‘viaggia’ con l’allele 1 del marcatore, nella famiglia 2 ‘viaggia’ con l’allele 3 dello stesso marcatore

Per il calcolo dei LOD SCORE vengono utilizzati programmi informatici  molto spesso le famiglie umane non sono così ‘ideali’ come quella che abbiamo appena visto Famiglia (c)  gli alleli A1 dei due rami della famiglia sono uguali per discesa?

Le mappe genetiche e le mappe fisiche sono sovrapponibili? Sì, per quanto riguarda l’ordine dei geni lungo i cromosomi No, per quanto riguarda la distanza che li separa Gli eventi di crossing-over non si distribuiscono in modo uniforme lungo i cromosomi: esistono zone ‘calde’ di ricombinazione (HSR = Hot Spot of Recombination), inoltre la frequenza dei crossing-over è più elevata nelle meiosi femminili che in quelle maschili

Nel genoma umano blocchi aplotipici sono separati da HSR

Mappe genetiche ottenute con meiosi femminili (in rosso) e maschili (in azzurro) e mappa fisica del cromosoma 18

Il no. di crossing over varia tra individui e tra gameti dello stesso individuo

Il marcatore ideale per studi di mappatura genetica deve essere: altamente polimorfico; analizzabile con una tecnica semplice e a basso costo; analizzabile su un materiale biologico facilmente reperibile; Marcatori ideali sono STR (Simple Tandem Repeats) e SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Analisi di linkage multipoint Il programma LINKMAP ricava la posizione del locus-malattia calcolando la probabilità complessiva dei dati variando la posizione del locus della malattia rispetto alla griglia dei marcatori

Quando si mappa un gene malattia bisogna fare attenzione alla possibilità di classificare come sani individui che sono in realtà ‘malati’ (penetranza incompleta e/o insorgenza tardiva) o viceversa (fenocopie)  classificazione errata di gameti P e R

Se la malattia presenta eterogeneità genetica di locus prima di mettere insieme dati provenienti da famiglie diverse bisogna accertarsi che in tutte le famiglie la malattia abbia la stessa causa genetica

E se questo non è possibile? Mappatura in singole famiglie con molti individui alla ricerca di aplotipi ‘condivisi’

L’approccio degli aplotipi condivisi è stato utilizzato anche per restringere la regione in cui mappa il gene della fibrosi cistica Alleli dei marcatori Cromosomi CF Cromosomi normali X1, K1 X1, K2 X2, K1 X2,K2 3 147 8 49 19 70 25

Con il metodo dei LOD SCORE si producono gruppi di associazione (o di sintenia). L’assegnazione ad un particolare cromosoma è possibile solo se almeno un marcatore del gruppo di associazione è stato assegnato ad uno specifico cromosoma (problema che oggi non si verifica più) Primi studi di mappatura genetica nell’uomo  anni ‘60-70 per molti anni risultati molto modesti: scarsità di siti polimorfici ABO - adenilatochinasi ABO - sindrome unghia-rotula Duffy - cataratta congenita Rh - ellissocitosi Colinesterasi - transferrina Lutheran - secretore G6PD - emofilia G6PD - daltonismo

Costruzione di una mappa marcatore-marcatore dell’intero genoma Anni ‘80 scoperta di marcatori analizzabili a livello di DNA (RFLP prima e STR poi) e coordinamento di vari gruppi a livello internazionale Famiglie CEPH = Centre pour l’Etude du Polymorphisme Humaine Costruzione di una mappa marcatore-marcatore dell’intero genoma

Il gene patologico mappa distalmente rispetto a S84. MAPPATURA RISPETTO A MARCATORI IN 12q p S 84 S 79 q S 84 S 84 S 105 S 234 S 129 S 354 S 79 S 129 Possibile localizzazione Il gene patologico mappa distalmente rispetto a S84. Localizzazione rispetto a S105 è ambigua a causa dell’omozigosità di I1

modalità di trasmissione L’analisi di linkage è un’analisi parametrica  richiede un preciso modello genetico  una serie di parametri devono essere noti: modalità di trasmissione frequenza della malattia e degli alleli del marcatore penetranza frequenza mutazione (sia del locus malattia che del locus marcatore) presenza di fenocopie presenza di eterogeneità genetica

Perché ci interessa mappare i geni? interesse di tipo evolutivo applicazioni pratiche il restringimento della regione cromosomica in cui mappa un gene-malattia costituisce il primo passo per la sua identificazione l’individuazione della regione cromosomica in cui mappa un gene-malattia ed il linkage con altri marcatori trova un’immediata applicazione nella consulenza genetica indiretta (diagnosi prenatale, diagnosi presintomatica, diagnosi dello stato di portatore), che è l’unica possibile quando non sia stato clonato il gene-malattia topografia del genoma

DIAGNOSI GENETICA Diretta  viene studiato il gene responsabile della malattia, è possibile solo se il gene è stato clonato e se ne conoscono le mutazioni patologiche

DIAGNOSI GENETICA Indiretta  viene utilizzata quando non si conosce il gene malattia o quando la ricerca diretta delle mutazioni ha dato esito negativo. Deve essere nota la localizzazione del gene rispetto a marcatori strettamente associati al gene (= che ricombinano raramente con il gene malattia). Può essere applicata a malattie a trasmissione AD, AR e X-linked. Il problema principale è rappresentato da diagnosi errate dovute alla ricombinazione

diagnosi genetica INDIRETTA come si procede nella diagnosi genetica INDIRETTA si cerca un marcatore informativo nella specifica famiglia in modo tale da poter distinguere i due cromosomi omologhi del/i genitore/i che potrebbe(ro) trasmettere la malattia si determina la fase di associazione tra l’allele-marcatore e l’allele malattia; si determina quale cromosoma sia stato trasmesso al probando

Malattia AR

Diagnosi genetica indiretta per una malattia Autosomica Dominante, la diagnosi è soggetta ad un errore la cui grandezza dipende dalla frequenza di ricombinazione tra locus marcatore e locus malattia

L’analisi di marcatori a monte e a valle del locus malattia permette di stabilire se si siano verificati eventi di ricombinazione: si diminuisce la probabilità di diagnosi errate

Diagnosi genetica indiretta per malattia X-linked recessiva III-2 non è portatrice, lo sarebbe se si fosse verificato un doppio crossing-over  evento estremamente improbabile