OPERONE LAC Biotecnologie per la Salute- GENETICA I Università degli studi di Napoli Federico II Prof. Massimo Zollo Prof. Mario de Felice Prof.ssa Gabriella de Vita Prof. Stefano Amente Assistente al corso Dott.ssa Veronica Ferrucci

Controllo della trascrizione nei procarioti OPERONE LAC Controllo della trascrizione nei procarioti

Tutte le cellule di un organismo: l’informazione genetica (DNA) è identica 46 cromosomi (2 coppie di autosomi ed 1 coppia di cromosomi sessuali) 1-2% porzione codificante Tutte le cellule di un organismo: l’informazione genetica (DNA) è identica

Tutte le cellule di un organismo: Hanno lo stesso corredo cromosomico ma Il FENOTIPO è differente I geni non sono tutti espressi in ogni momento, ogni cellula esprime solo una piccola parte del genoma. L’espressione di un gene (espressione genica) è specifica per ogni tipo cellulare e determina il fenotipo morfo-funzionale dei diversi tipi cellulari.

L’espressione di un gene deve essere controllata spazialmente e temporalmente. Durante lo sviluppo embrionale… In ogni momento dello sviluppo in ogni cellula è attivo solo un sottoinsieme di geni.

Realizzazione (PROTEINE e miRNAs) In tutte le cellule di un organismo: l’informazione genetica (DNA) è identica il prodotto dell’informazione (RNA e PROTEINE) è differente traduzione peptide RNA RNA regolativi Informazione (DNA) Mediazione (mRNA) Realizzazione (PROTEINE e miRNAs) Non tutti i geni si esprimono contemporaneamente nella cellula, vengono accesi o spenti a seconda delle necessità. Il genotipo è uguale Il fenotipo è differente

Espressione inducibile Espressione reprimibile Gene costitutivo gene espresso indipendente da altri segnali Gene regolato Espressione inducibile gene espresso in presenza segnale Espressione reprimibile gene represso in presenza di un segnale

Regolazione dell’espressione genica in procarioti eucarioti procarioti nucleo maturazione RNA

Si / no trascrizione RNA traduzione peptide Figura 8.2 L’espressione genica: Il flusso dell’informazione genetica dal DNA alla proteina, attraverso l’RNA. Nella trascrizione, l’enzima RNA polimerasi copia il DNA e produce un trascritto di RNA. Nella traduzione, il macchinario cellulare utilizza le istruzioni dell’mRNA per sintetizzare un polipeptide, seguendo le regole del codice genetico.

procarioti b b’ a s70 s70 b b’ a L’RNA polimerasi si lega al promotore La trascrizione inizia

Organizzazione di un gene inducibile o reprimibile controllo coding promotore terminatore RNA pol regolatore Il legame della polimerasi determina dove inizia la trascrizione Il legame del regolatore determina se inizia la trascrizione

SITO OPERATORE Sequenza di DNA, situata vicino al promotore, alla quale si legano proteine regolative (ATTIVATORI o REPRESSORI) coding promotore terminatore Sito operatore RNA pol regolatore

meccanismi di controllo positivo meccanismo di controllo negativo Controllo della trascrizione in procarioti attivatore RNA pol attivo repressore non attivo attivatori meccanismi di controllo positivo repressori meccanismo di controllo negativo

?

In presenza di lattosio:

Genetica del sistema lac Jacob e Monod : How could a cell possibly “know” precisely which enzymes to synthesize? How could a particular substrate induce the appearance of a specific enzyme?

Operone Lac in E. Coli Batterio Gram negativo Bacillo Aerobio/Anaerobio Facoltativo Commensale: Tratto GI dell’uomo E. Coli Base pairs Genes LAC OPERON 4,639,221 4,377 Z Y A b galattosidasi permeasi transacetilasi

DNA Lac Z Lac Y Lac A b galattosidasi galattosio glucosio +

DNA Lac Z Lac Y Lac A permeasi

DNA Lac Z Lac Y Lac A

Geni strutturali DNA RNA Lac Z Lac Y Lac A Z Y A b galattosidasi permeasi transacetilasi Geni strutturali Geni che codificano per proteine o RNA con funzione strutturale o enzimatica

GENI STRUTTURALI GENI REGOLATORI Geni che codificano per proteine o RNA con funzione strutturale o enzimatica Geni che codificano per proteine o RNA con funzione di regolazione dell’espressione genica

I O I REPRESSORE LAC I: Gene COSTITUTIVO Codifica per un repressore (si lega al sito operatore)

OPERONE Lac SPENTO trascrizione dell'operone LAC bloccata dal repressore, RNA polimerasi non può legarsi al promotore

OPERONE Lac ACCESO il repressore lac non lega l’operatore, la trascrizione può iniziare

I+ Y+ Z + P+ O+ - lattosio: Operone spento Il repressore lega il sito operatore I geni sono spenti + lattosio: Operone acceso Il repressore si stacca dal sito operatore I geni sono accesi I+ Y+ Z + P+ O+ RNA pol Repressore RNA pol Repressore lattosio Repressore

Sequenze CIS-Acting e Trans-acting Cis-acting DNA sequences: sequenze di DNA che fungono da siti di binding per proteine che controllano l’espressione di geni vicini Trans-acting genes: geni che codificano per proteine solubili che regolano l’espressione di geni su altre molecole di DNA I+ P+ O+ Z + Y+

Cis Trans-acting Geni strutturali Regolatore

Saggio colorimetrico per b-galattosidasi usando X-Gal come substrato: Jacob e Monod : Per capire se l’operone LAC era acceso o spento, misuravano l’attività della beta-galattosidasi (Gene Lac Z) con un saggio colorimetrico. Z Y A b galattosidasi permeasi transacetilasi Saggio colorimetrico per b-galattosidasi usando X-Gal come substrato:

Se l’operone LAC è acceso (in presenza di lattosio) Y A b galattosidasi permeasi transacetilasi Gene Lac Z è espresso B-galattosidasi è attiva X-Gal La crescita di colonie blu, Indica che l’operone Lac è acceso! Metabolizza X-Gal Colonie Blu

La b-galattosidasi non è espressa perché l’operone Lac è spento. Glucosio (operone lac spento) X-Gal Colonie bianche: La b-galattosidasi non è espressa perché l’operone Lac è spento. E. Coli: Lattosio o IPTG (operone lac acceso) Colonie blu: La b-galattosidasi è espressa perché l’operone è acceso. X-Gal

Jacob e Monod : IPTG (Iso-propil-tiogalattoside): Molecola strutturalmente simile al lattosio Induce l’espressione dei geni LAC Non viene metabolizzato dalla beta-galattosidasi La sua concentrazione rimane costante nella cellula durante gli esperimenti IPTG: non viene scisso dalla b-galattosidasi

Conseguenze delle mutazioni nei geni del sistema Lac Chemical mutagens E. Coli: L’operone Lac dovrebbe essere spento, le colonie dovrebbero essere bianche, ma…. X-Gal + glucosio Colonie bianche e blu! Lac operon acceso in assenza di lattosio! Jacob e Monod isolarono questi mutanti che esprimevano la b-galattosidasi anche in assenza di induttore (LATTOSIO o IPTG): MUTANTI COSTITUTIVI

Mutanti costitutivi: Mutazioni in Lac I: Mutazioni nel sito operatore (O):

Funzione del repressore: Mutanti costitutivi: Mutazioni in Lac I Funzione del repressore: Repressore RNA pol Repressore Normalmente, il repressore tiene spento l’operone Lac: Si lega al sito operatore Blocca il passaggio della polimerasi I geni lac sono spenti

mutanti “costitutivi”: esprimevano i geni anche in assenza di induttore 1) Se Lac I è mutato RNA pol Repressore mutato Repressore mutato Se il repressore è MUTATO, non lega il sito operatore La polimerasi passa I geni si esprimono SEMPRE (anche in assenza di lattosio)

mutanti “costitutivi”: esprimevano i geni anche in assenza di induttore 1) Se Lac I è mutato, il repressore non funziona (non lega il sito operatore) e l’operone è sempre ACCESO (anche in assenza di lattorio) I+ cells: sintetizzavano gli enzimi lac solo in presenza di induttore I− cells: sintetizzavano gli enzimi lac anche in assenza di induttore

2) Mutanti del sito operatore: Oc mutanti “costitutivi”: esprimevano i geni anche in assenza di induttore 2) Mutanti del sito operatore: Oc RNA pol Repressore Repressore Figura 16.7 I mutanti nel sito operatore. Il repressore non può riconoscere la sequenza di DNA alterata dei mutanti lacOc e quindi non può legarla per reprimere l’operone. Risultato: i geni per il lattosio sono costitutivamente espressi. Il sito operatore è mutato Il repressore non riconosce il sito operatore e non si lega La polimerasi passa I geni Lac sono sempre accesi (ANCHE SENZA LATTOSIO)

mutanti “costitutivi”: esprimevano i geni anche in assenza di induttore Se Lac I è mutato, il repressore non funziona e l’operone è sempre ACCESO Se il sito operatore è mutato, non viene riconosciuto dal repressore e l’operone è sempre ACCESO

Conseguenze delle mutazioni nei geni del sistema Lac Chemical mutagens E. Coli: L’operone Lac dovrebbe essere spento, le colonie dovrebbero essere bianche, ma…. X-Gal + glucosio Colonie bianche e blu! Lac operon acceso in assenza di lattosio! MUTANTI COSTITUTIVI

Come distinguere i 2 tipi di mutazioni? Mutanti costitutivi: Mutazioni in Lac I: repressore inattivo Operone Lac sempre acceso Mutazioni nel sito operatore Il repressore non riconosce il sito operatore Il repressore non si può legare al sito operatore Come distinguere i 2 tipi di mutazioni?

Fu necessario usare sistemi diploidi (Cellule con 2 operoni Lac) coniugazione batterica: una cellula batterica trasferisce porzioni di DNA ad un'altra tramite un contatto cellula-cellula. fattore F: trasmesso grazie alla sintesi di estroflessioni (pili) che prendono contatto con una cellula ricevente, rendendo possibile il passaggio di DNA.

I+ Y+ Z + O+ P+ I+ Y+ Z + O+ P+ Jacob e Monod studiarono gli effetti di varie mutazioni usando E.Coli contenente 2 copie dell’operone Lac plasmide F’ I+ Y+ Z + O+ P+ Cromosoma batterico I+ Y+ Z + O+ P+ La regolazione dell’operone Lac dipende da Cis-acting DNA sequences E Trans-acting Proteins

Come distinguere l’operone sul plasmide da quello sul cromosoma? plasmide F’ I+ Y+ Z + P+ Z - O+ Cromosoma batterico b-galattosidasi mutata (non funzionante) Utilizzarono un mutante per la beta galattosidasi. La beta galattosidasi (cromosomica) non era funzionante.

Mutanti del sito operatore: eterozigote O+ / Oc I mutanti del sito operatore prevengono il legame del repressore: I geni sono sempre accesi anche senza induttore plasmide F’ I+ Y+ Z + P+ Z - O+ Cromosoma batterico Oc Qual’è la funzione del SITO OPERATORE?

I+ Y+ Z + P+ O+ In condizioni wild type: - IPTG: Operone spento Il repressore lega il sito operatore I geni sono spenti + IPTG: Operone acceso Il repressore si stacca dal sito operatore I geni sono accesi I+ Y+ Z + P+ O+ RNA pol Repressore RNA pol Repressore IPTG Repressore

Mutanti dell’operatore: eterozigote O+ / Oc - IPTG: plasmide F’ I+ Y+ Z + P+ I+ Y+ Z - O+ P+ Repressore Cromosoma batterico RNA pol Oc RNA pol Repressore Il repressore (gene costitutivo) riconosce e si lega a O+ sul plasmide; I geni adiacenti a O+ (sul plasmide) sono spenti Il repressore non rinonosce Oc (sul cromosoma); I geni adiacenti a Oc (sul cromosoma) sono trascritti anche senza IPTG Oc è una mutazione DOMINANTE. Una sola copia è sufficiente per far esprimere in geni lac da queste cellule anche senza IPTG (o lattosio).

Mutanti dell’operatore: eterozigote O+ / Oc - IPTG: plasmide F’ - IPTG: I+ Y+ Z + P+ I+ Y+ O+ P+ Z - Repressore Cromosoma batterico RNA pol Oc RNA pol Permeasi wt b-galattosidasi mutata Repressore Le cellule esprimono solo la permeasi funzionante, non la b-galattosidasi, (quindi solo operone del cromosoma). La mutazione Oc fa trascrivere COSTITUTIVAMENTE solo i geni adiacenti sul cromosoma batterico, non quelli sul plasmide: Oc è CIS Se OC agisse in trans, le cellule esprimerebbero anche la b-galattosidasi funzionante codificata da Z+ sul plasmide

+ IPTG: I+ Y+ Z + P+ Z - O+ Oc plasmide F’ Cromosoma batterico IPTG RNA pol Repressore IPTG RNA pol Il repressore si stacca da O+ sul plasmide; I geni adiacenti a O+ (sul plasmide) sono accesi, insieme a quelli sul cromosoma. Oc è cis

La mutazione del sito operatore Oc è cis-dominante Nell’ eterozigote O+ / Oc: i geni Lac sono sempre accesi anche se la mutazione è in singola copia La mutazione è CIS: sono attivi solo i geni adiacenti alla mutazione OC Le cellule esprimono sia b-galattosidasi che permeasi funzionali Oc è dominante su O+ Oc è cis-dominante

Mutanti del repressore lac I- Y+ Z + O+ P+ RNA pol Repressore mutato Repressore wt Segue… Nei mutanti lacI- il repressore non può legarsi al sito operatore e quindi non può reprimere l’operone. Figura 16.6 Analisi mutazionale e strutturale del repressore. (a) Nei mutanti lacI- il repressore non può legarsi al sito operatore e quindi non può reprimere l’operone. (b) Nei mutanti super-repressori lacIs il repressore si lega all’operatore ma non può legarsi all’induttore, quindi il repressore non si stacca mai dall’operatore e i geni sono continuamente repressi. La mutazione è dominante o recessiva? Cis o Trans? Test con alleli I+ and I− nei sistemi diploidi

I- Y + I- P+ P+ O+ O+ Z+ Z + Y+ I+ P+ Z + Y+ O+ I+ P+ Y + O+ Z + Eterozigote I+ Z + Y+ / I- Z + Y+ I- Y + I- P+ P+ O+ O+ Z+ Z + Y+ I+ P+ Z + Y+ O+ I+ P+ Y + O+ Z + I+ in singola copia è sufficiente a produrre un repressore che si lega ad entrambi i siti operatore (plasmide e cromosoma); Inibisce così la trascrizione dei geni lac su entrambi gli operoni I+ è dominante su I− I agisce in trans

- + - + + + + + - + - + Il repressore agisce in trans La mutazione I- è recessiva I+ Y+ Z + O+ P+ ind. no Lac Z si Lac Y genotipo I+ è inducibile I+ Z + Y+ - + - + I- Z + Y+ + + + + I- è costitutivo I+ Z + Y+ / I- Z + Y+ - + - + I- è recessivo

Z - Mutazioni del promotore I+ Y+ Z + O+ P- I+ Y+ O+ P+ L’RNA polimerasi non riconosce il promotore

Mutazioni del promotore Y+ Z + O+ P- Rna Pol I+ Y+ Z - O+ P+ Rna Pol L’RNA polimerasi non potrà legarsi al promotore Trascrizione dei geni lac spenta Cis

Mutanti del repressore lac Is + IPTG I+ Y+ Z + O+ P+ lac Is IPTG IPTG Il repressore wt lega l’IPTG e si stacca dall’operatore; si attiva la trascrizionedei geni Lac Il repressore LacIS Si lega IRREVERSIBILMENTE all’operatore Is non può legarsi all’induttore (lattosio o IPTG) inibisce IRREVERSIBILMENTE la trascrizione dei geni lac

I- Y + IS P+ P+ O+ O+ Z+ Z + Y+ I+ P+ O+ Z + Y+ I+ P+ Z + Y + O+ Eterozigote I+ Z + Y+ / IS Z + Y+ + IPTG I- Y + IS P+ P+ O+ O+ Z+ Z + Y+ IPTG I+ P+ O+ Z + Y+ I+ P+ Z + Y + O+ Is non può legarsi all’induttore (lattosio o IPTG) Si lega IRREVERSIBILMENTE all’operatore e inibisce la trascrizione dei geni lac Il prodotto di I+ può legarsi all’induttore, ma non all’operatore che è occupato dal prodotto di Is La mutazione IS è dominante

- + - + - - - - - - - - La mutazione IS è dominante genotipo I+ Z + Y+ ind. no Lac Z si Lac Y genotipo I+ è inducibile I+ Z + Y+ - + - + ISZ + Y+ - - - - IS sempre represso IS Z + Y+ / I+ Z + Y+ - - - - IS è dominante

Mutazioni I- e IS I- recessiva Is dominante Nei mutanti lacI- il repressore non può legarsi al sito operatore e quindi non può reprimere l’operone. Nei mutanti super-repressori lacIs il repressore si lega all’operatore ma non può legarsi all’induttore, quindi il repressore non si stacca mai dall’operatore e i geni sono continuamente repressi.

lac operon model The three genes Z, Y, and A are coordinately expressed The product of the I gene, the repressor, blocks the expression of the Z, Y, and A genes by interacting with the operator (O). The inducer can inactivate the repressor, thereby preventing interaction with the operator. When this happens, the operon is fully expressed.

Modello proposto da Jacob e Monod della regolazione trascrizionale dell’operone Lac dal repressore: - Lattosio

Modello proposto da Jacob e Monod della regolazione trascrizionale dell’operone Lac dal repressore: + Lattosio