Validation

Validazione Per valutare la qualità di una struttura si deve di solito ricorrere a diversi parametri. Mentre, infatti, nel caso di strutture di piccole molecole determinate ad alta risoluzione la conoscenza delle deviazioni standard sulle coordinate atomiche e sui fattori termici è di per sé sufficiente, questi valori sono di solito non noti, o comunque di non facile ottenimento, nel caso della struttura di una macromolecola. Infatti, le deviazioni standard sulle variabili usate nell’affinamento si possono ottenere dagli elementi diagonali della matrice di covarianza dei minimi quadrati. Nell’affinamento della struttura di macromolecole, però, si ricorre solitamente a metodi diversi dall’inversione di matrice per risolvere il sistema di equazioni (ad esempio, metodo dei gradienti coniugati), oppure si affina la struttura usando il metodo della dinamica molecolare.

Validazione si ricorre di solito ad altri fattori, che nel loro insieme danno una buona stima della qualità, o globale o locale, della struttura. Alcuni di questi sono: indice cristallografico R-factor e Rfree; risoluzione; grafico di Ramachandran e parametri collegati; fattori di temperatura.

Rfree For the purposes of cross validation we may chose to omit some of our data.

If 10% of the reciprocal space data are omitted in thin spherical shells, then the following images are obtained: Using Free-Reflections is a good validation of coordinate refinement, but is unwise when calculating maps. Particular care must be taken when using free-sets in density modification calculations, as the absence of the free-set can systematically bias the rest of the data.

Il grafico di Ramachandran e la stereochimica Il grafico o plot di Ramachandran è stato ideato da vari gruppi all’inizio degli anni ’60 ed è chiamato in questo modo perché la forma in cui ancora oggi è conosciuto risale ad un lavoro di un noto cristallografo indiano, .. Ramachandran (JMB, 1964). L’idea su cui si basa è molto semplice: quando ruotiamo attorno ad uno dei due legami semplici della catena polipeptidca di una proteina, f o y, ci sono molti valori di uno o di entrambi questi angoli di torsione per i quali si verifica una sovrapposizione di qualche atomo della catena polipeptidica. Questo vale qualunque sia l’amminoacido che stiamo considerando, la sovrapposizione riguarda cioè gli atomi della catena principale e il carbonio b (quest’ultimo non è presenta nella glicine, che pertanto ha un grafico di Ramachandran speciale, diverso da quello degli altri aminoacidi). In un grafico di Ramachandran, sui due assi vengono rappresentati i valori di f e y, che vanno da -180° a +180°; delle curve delimitano le aree che comprendono coppie di valori di angoli di torsione “permessi”, cioè che non danno origine a sovrapposizione tra atomi non legati covalentemente, e coppie “proibite”, cioè valori di angoli per i quali la sfera di van der Waals di un atomo andrebbe a compenetrare quella di un altro[1]. Più correttamente, programmi come PROCHECK distinguono tra zone “most favoured”, “additionally allowed”, “geneorusly allowed”, “disallowed”.

Il significato di questo grafico nel corso dell’affinamento difficilmente può essere sottostimato: gli aminoacidi i cui valori cadono in zone proibite sono quasi sicuramente mal collocati nella mappa di densità elettronica e vanno corretti. In una struttura completamente affinata ci si aspetta che tutti o quasi gli amminoacidi abbiano coppie di angoli di torsione che cadono in zone permesse, con l’eccezione della glicina.

PROGRAMMI DI VALIDAZIONE PROCHECK, a partire dalle coordinate atomiche del modello, effettua un’analisi stereochimica e fornisce una serie di diagrammi nei quali è riassunta la qualità della struttura. La stereochimica del modello è confrontata con quella risultante da un’analisi statistica relativa a strutture cristallografiche ben affinate ( minore di 0.20) e determinate ad una risoluzione vicina a quella relativa alla proteina in esame. Il programma di validazione WHATCHECK confronta proprietà quali lunghezze e angoli di legame, angoli torsionali, planarità del legame peptidico, chiralità e planarità dei residui amminoacidici e angoli χ, con quelli di strutture ben affinate.

Un altro indice di bontà della struttura è fornito dall’andamento del fattore termico di atomi dello stesso residuo o di residui consecutivi. Emblematici quei casi in cui atomi contigui sono caratterizzati da fattori termici molto differenti tra loro: la consistenza interna di questo parametro è molto spesso usata come criterio di valutazione.