Il superavvolgimento del DNA Il DNA è avvolto attorno ad un’asse immaginario sottoforma di doppia elica Ogni ripiegamento o torsione di tale asse su se stesso è definito come SUPERAVVOLGIMENTO del DNA Se non vi è nessun ripiegamento il DNA è in uno stato RILASSATO

Il superavvolgimento del DNA Importante aspetto intrinseco alla struttura terziaria del DNA Ubiquitario nel DNA cellulare Altamente regolato in ogni cellula Il DNA deve essere altamente compattato per trovare spazio all’interno della cellula L’impacchettamento deve permettere l’accesso all’informazione contenuta nel DNA (replicazione, trascrizione) La Duplicazione e la Trascrizione richiedono una temporanea separazione delle eliche di DNA senza che la molecola subisca danni Il superavvolgimento è indotto dalla separazione delle catene di una struttura a doppia elica Se i due filamenti vengono separati tirando, la tensione risultante produrrà un superavvolgimento a monte IL SUPERAVVOLGIMENTO AVVIENE QUANDO IL DNA È SOTTOPOSTO AD UNA SORTA DI DEFORMAZIONE STRUTTURALE

Il grado di deformazione indotta viene finemente regolato dalla cellula La deformazione è il risultato di un parziale disavvolgimento del DNA Il DNA presenta un numero di giri d’elica pari a 8 (10,5 bp 9 Il DNA è deformato e presenta un numero di giri d’elica pari a 7 (minore) La rimozione di un giro induce una deformazione strutturale che può essere risolta con: C) la formazione di un superavvolgimento D) La separazione delle catene per un tratto di 10,5 coppie di basi (un giro d’elica)

Molecola di DNA circolare superavvolta Molecola di DNA circolare rilassata Molecola di DNA circolare superavvolta

Il disavvolgimento locale del DNA facilita la parziale separazione delle catene necessaria a promuovere la formazione di strutture secondarie (cruciformi o stelo ed ansa) (ruolo fuinzionale)

TOPOLOGIA DEL DNA Topologia = Studio matematico delle proprietà di un oggetto che non cambiano sotto continue deformazioni PROPRIETÀ TOPOLOGICHE DEL DNA non è alterato dalla torsione e dal ripiegamento dell’asse Può essere modificato soltanto con la rottura ed il ricongiungimento della sua ossatura Una molecola di DNA circolare chiusa in struttura B risulterà rilassata piuttosto che superavvolta La struttura del DNA è sottoposta a tensioni tali da indurre una deformazione che si traduce in un superavvolgimento

Lk è una proprietà topologica del DNA IL NUMERO DI LEGAME LK IL NUMERO DI VOLTE CHE UN FILAMENTO DEVE ESSERE PASSATO ATTRAVERSO L’ALTRO AFFINCHE’ LE DUE CATENE POSSANO SEPARARSI O AVVITARSI L’UNA DALL’ALTRA Specifica rigorosamente il numero dei giri dell’elica in un DNA circolare chiuso in assenza di superavvolgimento Lk è una proprietà topologica del DNA non varia quando la doppia elica subisce qualunque tipo di torsione o deformazione Varia solo se una delle catene di DNA si interrompe

Il numero di legame (linking number) L ha due componenti: il numero di twisting o di avvolgimento (T) e il numero di writhing o di superavvolgimento (W). Il numero di twisting, T, rappresenta il numero di volte che un filamento gira intorno all’altro Per una molecola di DNA circolare chiusa e rilassata, giacente su un piano, T è dato dal numero totale delle coppie di basi diviso per il numero di coppie di basi per giro (10,5) T = Lk Il numero di writhing, W, rappresenta il numero di incroci dell’asse del duplex nello spazio e su se stesso. Corrisponde al concetto intuitivo di superavvolgimento Per una molecola di DNA circolare chiusa e rilassata, W = 0

DNA CIRCOLARE RILASSATO Lk = n° coppie di basi n° coppie di basi x giro dell’elica(10,5) Lk = 2100 = 200 10.5 Rilassata con interruzione Lk = indefinito Disavvolta di due giri Lk = 198 LA MOLECOLA PARZIALMENTE DISAVVOLTA SI PRESENTA COME UNA STRUTTURA SUPERAVVOLTA

Separazione delle molecole rilassate e superavvolte

RILASSAMENTO DEL DNA MEDIANTE DNASI I Nick = interruzione di un legame fosfodiesterico su un solo filamento della doppia elica Dopo un nick la doppia elica non è più topologicamente costretta I due filamenti possono liberamente ruotare l’uno rispetto all’altro Se il nick viene riparato il DNA sarà rilassato

LK PUÒ ESSERE CAMBIATO SOLAMENTE PROVOCANDO UNA INTERRUZIONE DEI LEGAMI FOSFODIESTERICI DI ALMENO UNA DELLE DUE CATENE DEL DNA TOPOISOMERASI Determinano un cambiamento del numero di legame topologico Determinano l’aumento o la diminuzione del grado di disavvolgimento del DNA Possono rilassare il DNA superavvolto Determinano una rottura temporanea dei due filamenti del DNA attraverso la quale può passare un tratto di elica integra prima che il taglio venga risaldato Sono necessarie per cambiare la struttura del DNA in modo tale che la replicazione e la trascrizione possano procedere

TOPOISOMERASI Si suddividono in due classi: Tipo I cambiano la topologia del DNA producendo una rottura transitoria e risaldando un singolo filamento del DNA Tipo II cambiano la topologia del DNA producendo una rottura transitoria e risaldando entrambi i filamenti del DNA In E.coli ci sono 4 topoisomerasi differenti: Le DNA topoisomerasi I e III sono di tipo I Le DNA topoisomerasi II (girasi) e IV sono di tipo II

Le topoisomerasi di tipo I agiscono formando un legame covalente con una delle estremità tagliate, facendo passare un filamento intorno all’altro, quindi trasferendo l’estremità legata sull’altra estremità tagliata. Poiché i legami sono conservati, non è necessario nessun apporto di energia

Le topoisomerasi di tipo II possono catalizzare il passaggio di un DNA duplex attraverso una rottura a doppio filamento in un altro duplex Poiché i legami non sono conservati, è necessario apporto di energia La reazione richiede quindi l’idrolisi di una molecola di ATP per ogni evento catalitico

La DNA girasi di E.coli La girasi di E.coli è una topoisomerasi di tipo II che usa l’idrolisi di ATP per fornire l’energia necessaria all’ introduzione di superavvolgimenti in una molecola circolare chiusa rilassata Si lega al DNA e lo superavvolge processivamente e cataliticamente Continua ad introdurre superavvolgimenti nella stessa molecola di DNA Può introdurre circa 100 superavvolgimenti al minuto

Meccanismo di azione della Topoisomerasi di tipo II Introduce superavvolgimenti utilizzando l’energia dell’ATP L’estremità 5’ del DNA è legata covalentemente alla proteina Gli inibitori della DNA girasi sono efficienti antibiotici (ad esempio la ciprofloxacina, la novobiocina).

È indispensabile l’intervento di una topoisomerasi di tipo II Il superavvolgimento causato da un parziale disavvolgimento produrrà un superavvolgimento NEGATIVO Il superavvolgimento causato da un maggiore avvolgimento produrrà un superavvolgimento POSITIVO È indispensabile l’intervento di una topoisomerasi di tipo II

Modello della DNA topoisomerasi II

TOPOISOMERASI I meccanismo di azione FILMATO DA CD BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE