Parte 5 Estrazione e quantificazione del DNA nella genetica forense (Iacovacci)
Estrazione & Quantificazione del DNA estratto Magg inv sc Giuseppe IACOVACCI Direttore della Sezione 4^ della Banca Dati Nazionale del DNA giuseppe.iacovacci@carabinieri.it
ESTRAZIONE DEL DNA DAL CAMPIONE
Walsh et al Biotecniques 1991; 10: 506 IL PROTOCOLLO CHELEX Walsh et al Biotecniques 1991; 10: 506 Prevede la bollitura della traccia in una sospensione acquosa al 5% della Resina Chelex 100 e l’utilizzo diretto del supernatante in PCR. Rapido (da 15’ a 90’), economico (meno di 0.50 €/reazione) e con altissima resa (fino al 98%) Ha il difetto di produrre un estratto poco “pulito” e che si degrada in tempi brevi se conservato a +4° inoltre è diluito in un volume che supera i 300 ul Reperti ammessi.
PROTOCOLLO CLASSICA METODO SINGLE TUBE Sambroock et al Molecular cloning 1988 adattato da McIndoe et al Biotecnicques 1995; 19: 30 Prevede diverse fasi condotte in una unica provetta vacutainer con resina, fino alla precipitazione etanolica o filtrazione su microcon. Il protocollo è stato scomposto in punti successivi che possono essere adattati ai diversi reperti. Laborioso, prevede l’uso di solventi organici, resa circa 40% Purifica discretamente adattabile ad un ampia tipologia di tracce Reperti ammessi. 1 Pretrattamento 2 Digestione 3 Estrazione organica STAIN EXTRACTION BUFFER Composizione.- 10 mM Tris-HCl pH 8.0 >>>>>>>1: 100 di una madre 1 M 100 mM NaCl > MW 58.44>>>>>5.8 g\l 10 mM EDTA >MW 372.2 >>>>>3.7 g/l del sale sodico diidrato 2% SDS >>>>>>>>>>>>>>>>>>>20 g\l 39 mM DTT > MW 154.2>>>>>>>6.2 g\l Rif. Techinical manual GenePrintTM STR System (Silver Stain Detection) Revised 5/98
Estrazione Differenziale I
Estrazione Differenziale II
Campionamento delle impronte mediante tamponi Prionics® con acetone e eluente del kit Hexagon OBTI®
Utilizzo di resine di silice Il metodo si basa sull’affinità che il DNA, trattato con sali caotropici (isotiocianato di guanidinio), ha verso la silice. EZ1 QIAcube
Importanza della quantificazione
Importanza della quantificazione
Importanza della quantificazione
Eccesso di DNA in amplificazione Difetto di adenilazione Pull up Aumento del rumore di fondo Pull up
Difetto di DNA in amplificazione In queste condizioni l’analisi risulta affetta da problemi stocastici in questo caso dobbiamo interpretare il dato con un approccio LCN o LT
Normalizzazione Effettuabile con un liquid handler in automatico sulla base della quantificazione a meno di misture
Quantificazione del DNA estratto DOT-BLOT ELETTROFORESI GEL AGAROSIO LA SPETTROFOTOMETRIA “UV” LA FLUORIMETRIA
Plexor® HY Amplification Targets 4-color, triplex Plexor® qPCR assay Autosomal – fluorescein 99bp multicopy target (RNU2) on chromosome 17 repeated motif ~6kb Locus is conserved in primates Y – Cal Orange 560 133bp multicopy target (TSPY/DYZ5) on short arm repeat motif ~20kb IPC – Cal Red 610 150bp, novel target Normalizzatore di fluorescenza Multicopy targets Increased sensitivity and reduced impact of primer site mutation Autosomal and Y have similar copy number
Quantifiler Trio® LOQ a 5 pg/ul; Solo 5 punti per la curva standard. Possibilità di monitorare la degradazione. Protocollo già validato ed inserito nel Metodo Interno
Power Quant®
Power Quant® LOQ a 3 pg/ul; Solo 4 punti per la curva standard. Possibilità di monitorare la degradazione