Nelle cellule aploidi dell’uomo C = 3.5 x 10-12 g (3 x 109 bp); n = 23 Il ciclo cellulare Il contenuto di DNA (C) e il numero (n) di cromosomi variano nelle diverse fasi del ciclo Nelle cellule aploidi dell’uomo C = 3.5 x 10-12 g (3 x 109 bp); n = 23

in G1  cromosomi = 2n DNA = 2C in G2  cromosomi = 2n DNA = 4C Modificato da: Strachan e Read, ‘Genetica molecolare umana’, editore Zanichelli

Nell’uomo si stima che nel corso della vita di un individuo si verifichino 1017 divisioni cellulari

2 cellule figlie ciascuna con 2n cromosomi MITOSI MEIOSI 2 cellule figlie ciascuna con 2n cromosomi R.Lewis, ‘Genetica umana’, editore Piccin

La meiosi assicura la corretta trasmissione dell’informazione genetica ed è fonte di una notevole diversità: Assortimento indipendente Crossing-over

Assortimento indipendente dei cromosomi materni e paterni, sono possibili 223 combinazioni cioè più di 8 milioni

Il crossing-over, oltre a generare nuove combinazioni geniche, è probabilmente essenziale per la corretta segregazione dei cromosomi omologhi, i chiasmi tengono uniti i membri di ciascuna coppia di omologhi fino all’ananfase I

I cromosomi sono visibili solo durante la divisione cellulare (compaiono in prometafase), sono quindi studiati in cellule in coltura che vengono stimolate a dividersi (aggiunta di fitoemoagglutinina) e bloccate in metafase (uso di sostanze che impediscono la formazione del fuso mitotico) Le cellule più comunemente usate per studiare i cromosomi sono: Linfociti Fibroblasti Cellule del liquido amniotico Cellule dei villi coriali

Istoni dell’ottamero: H2A, H2B, H3 e H4 Modificato da: Strachan e Read, ‘Genetica molecolare umana’, editore Zanichelli L’organizzazione in solenoidi permette una condensazione 50x, i cromosomi metafasici sono condensati 10 000x

ELEMENTI FONDAMENTALI DEL CROMOSOMA origini di replicazione centromero telomeri Necessari per la duplicazione, la corretta trasmissione alle cellule figlie e la stabilità del cromosoma

CENTROMERO (o costrizione primaria) Struttura essenziale per l’attacco alle fibre del fuso e per la corretta segregazione dei cromosomi nelle cellule figlie L’organizzazione e la grandezza dei centromeri variano molto da specie a specie (nonostante la conservazione della loro funzione) Homo sapiens  DNA alfa-satellite unità di 171 bp ripetuta migliaia di volte. L’esatta sequenza centromerica è cromosoma-specifica (sonde cromosoma-specifiche)

La regione centromerica è costituita dalla stretta associazione tra sequenze specifiche di DNA e proteine. Le sequenze centromeriche sono sito di interazione con le proteine del cinetocoro che interagiscono con il fuso mitotico

ORGANIZZAZIONE STRUTTURALE DEL CENTROMERO nei cromosomi eucariotici Costituito di eterocromatina; contiene blocchi di sequenze di DNA altamente ripetitivo; le interazioni tra sequenze e proteine specifiche non permettono il normale livello di condensazione della cromatina, in mitosi. In questa regione il livello di condensazione della cromatina è molto ridotto; osservata in mitosi, questa regione risulta più sottile.

Singolo punto di attacco al microtubulo Molteplici punti di attacco ai microtubuli Molteplici punti di attacco ai microtubuli Molteplici punti di attacco ai microtubuli – centromero diffuso da: Strachan e Read, ‘Genetica molecolare umana’, editore Zanichelli

TELOMERI Complessi eterocromatici costituiti da DNA e proteine Hanno la funzione di proteggere il cromosoma: cromosomi privi di telomeri sono instabili e tendono a fondersi con altre estremità instabili o a essere degradati Le sequenze telomeriche mostrano un elevato grado di conservazione, in tutti i vertebrati la sequenza telomerica è TTAGGG ripetuta in blocchi di 10-15 kb (nei cromosomi umani)

da: Strachan e Read, ‘Genetica molecolare umana’, editore Zanichelli

Replicazione dei TELOMERI

La doppia elica di DNA è costituita da due singoli filamenti ‘anti-paralleli’, uno con polarità 5’  3’ e l’altro con polarità opposta da: Strachan e Read, ‘Genetica molecolare umana’, editore Zanichelli

da: Strachan e Read, ‘Genetica molecolare umana’, editore Zanichelli La DNA polimerasi aggiunge nucleotidi in direzione 5’  3’ e non è in grado di iniziare la sintesi in assenza di un filamento di innesco (disponibilità di un gruppo 3’ OH libero)

Filamento di nuova sintesi 5’ 3’ Filamento parentale Filamento di nuova sintesi Direzione sintesi 5’ 3’ Direzione sintesi 5’ 3’ Direzione sintesi

Nelle cellule adulte l’attività della telomerasi è quasi assente La telomerasi ha una componente a RNA grazie alla quale il filamento parentale viene allungato ‘artificialmente’ In assenza di telomerasi si ha un progressivo accorciamento dei telomeri Nelle cellule adulte l’attività della telomerasi è quasi assente da: Strachan e Read, ‘Genetica molecolare umana’, editore Zanichelli

Cariotipo umano 1956 Accertamento del no. di cromosomi (Tjio e Levan), i 23 cromosomi dell’assetto aploide vengono suddivisi in 7 gruppi (A-G) sulla base delle dimensioni e della posizione del centromero da: ‘Genetica’ – a cura di Pimpinelli, CEA

Buono il livello di condensazione dei cromosomi, ma troppo vicini, contorti e sovrapposti Buona la dispersione, ma cromosomi troppo contratti (troppo tempo in colchicina)

La posizione del centromero permette di suddividere i cromosomi in: R.Lewis, ‘Genetica umana’, editore Piccin La posizione del centromero permette di suddividere i cromosomi in: Telocentrici Acrocentrici Submetacentrici Metacentrici

Il CARIOTIPO  numero e morfologia di tutti i cromosomi presenti nel nucleo della cellula di un determinato organismo. Nell’uomo il cariotipo standard è 46, XX per le femmine e 46, XY per i maschi CARIOGRAMMA  rappresentazione ‘ordinata’ del completo assetto cromosomico mitotico di un individuo, mostrato come coppie di cromosomi omologhi A ciascun cromosoma della ‘piastra cromosomica’ dell’individuo studiato viene appaiato il suo omologo e ciascuna coppia di omologhi viene disposta in ordine decrescente, per dimensioni e posizione del centromero IDIOGRAMMA  rappresentazione ‘ideale’ e schematica del cariotipo standard di una determinata specie riferito a tutte le sue caratteristiche morfologiche e al pattern di bandeggio (generalmente bande G)

(a) (b) Ideogrammi del cariotipo umano in (a) metafase e (b) prometafase (in ‘alta risoluzione’)

CARIOGRAMMI DI INDIVIDUI DI SESSO MASCHILE

Cariotipo umano 1970 Introduzione delle tecniche di bandeggio: diventa possibile individuare i singoli cromosomi Braccio corto = p (petit) Braccio lungo = q (queue) Le bande vengono numerate con numeri progressivi dal centromero verso i telomeri Le bande prossimali sono quelle più vicine al centromero, quelle distali sono quelle verso i telomeri Una singola banda è composta da 5-10 Mb ISCN, International System for Cytogenetic Nomenclature

Bandeggio  consente di identificare i singoli cromosomi e di individuare eventuali anomalie strutturali (delezioni, duplicazioni, inversioni di regioni estese o traslocazioni) Esistono diverse tecniche di bandeggio che si differenziano per il tipo di trattamento e/o di coloranti utilizzati. I coloranti si legano in maniera specifica a zone ricche in A/T o in G/C o a regioni costituite da eterocromatina Prima tecnica di bandeggio utilizzata  bandeggio Q (mostarda di quinacrina, sostanza fluorescente)

1971 - bandeggio G  i cromosomi sono sottoposti a digestione controllata con tripsina e colorati con Giemsa (composto chimico che si lega al DNA) Bandeggio C  mette in evidenza i blocchi di eterocromatina Bandeggio R (Reverse)  colorazione con Giemsa dopo denaturazione termica

Cariogramma di un individuo di sesso femminile della nostra specie

Cariogramma di un individuo di sesso maschile della nostra specie

Bandeggio di un cromosoma umano a diversi livelli di risoluzione Strachan e Read, ‘Genetica molecolare umana’, editore Zanichelli

Il cromosoma 21 a vari livelli di risoluzione Strachan e Read, ‘Genetica molecolare umana’, editore Zanichelli

Con le tecniche di bandeggio il riconoscimento dei cromosomi avviene su base morfologica, le metodiche di citogenetica molecolare consentono l’identificazione dei cromosomi (o di parte di essi) basandosi sull’omologia di sequenza  uso di sonde marcate FISH  Fluorescent In Situ Hybridization

Strachan e Read, ‘Genetica molecolare umana’, editore Zanichelli Su cromosomi metafasici la max risoluzione possibile è di diverse Mb, utilizzando cromosomi prometafasici si arriva a risoluzioni di 1 Mb

Strachan e Read, ‘Genetica molecolare umana’, editore Zanichelli Su cromosomi metafasici la max risoluzione possibile è di diverse Mb, utilizzando cromosomi prometafasici si arriva a risoluzioni di 1 Mb

Sonda fluorescente per il cromosoma 21 Visualizzare i cromosomi ieri e oggi schizzo del 1882 marcatura con sonde fluorescenti R.Lewis, ‘Genetica umana’, editore Piccin Sonda fluorescente per il cromosoma 21

Identificazione di una microdelezione sul cromosoma 22 In verde sonda di controllo per identificare il cromosoma 22

alterazioni del numero alterazioni della struttura MUTAZIONI CROMOSOMICHE = cambiamenti che producono un’alterazione visibile dei cromosomi alterazioni del numero (poliploidie, monosomie, trisomie) alterazioni della struttura (inversioni, delezioni, duplicazioni, traslocazioni)

Tutte queste anomalie possono essere presenti in tutte le cellule di un individuo o in una parte di esse (mosaici) R.Lewis, ‘Genetica umana’, editore Piccin

UN PO’ DI NOMENCLATURA 46, XX cariotipo normale femminile 46, XY cariotipo normale maschile Anomalie di numero 45, X 47, XX +21 47, XXX Anomalie di struttura delezioni 46, XY, del(4)(p16.3) 46, XX, del(5)(q13q33) inversione 46, XY, inv(11)(p11p15) duplicazione 46,XX, dup(1)(q22q25) inserzione 46, XX, ins(2)(p13q21q31) traslocazione reciproca 46, XX, t(2;6)(q35;p21.3) traslocazione Robertsoniana 45, XY, der(14;21) In caso di mosaicismo i due cariotipi che coesistono nello stesso individuo vengono indicati entrambi separati da /

Origine delle poliploidie Strachan e Read, ‘Genetica molecolare umana’, editore Zanichelli

Come si originano monosomie e trisomie ? Unione di un gamete normale (euploide), cioè con 23 cromosomi con un gamete aneuploide (22 o 24 cromosomi) Gameti con 22 cromosomi vengono chiamati NULLISOMICI Gameti con 24 cromosomi vengono chiamati DISOMICI Non disgiunzione mitotica in una fase precoce dello sviluppo embrionale (spesso mosaici)

La non disgiunzione meiotica produce gameti disomici e gameti nullisomici Le aneuploidie sono rare alla nascita (ca. 0.1% dei nati vivi) ma si riscontrano nel 5% delle gravidanze riconosciute R.Lewis, ‘Genetica umana’, editore Piccin

Le uniche trisomie compatibili con uno sviluppo intra-uterino completo sono quelle a carico dei cromosomi 13, 18 e 21 R.Lewis, ‘Genetica umana’, editore Piccin

Le trisomie sono rare alla nascita e relativamente frequenti negli aborti spontanei Le monosomie sono incompatibili con la vita, si riscontrano raramente anche negli aborti spontanei  feti monosomici vengono abortiti in fasi estremamente precoci (prima ancora che la gravidanza venga riconosciuta)

Il rischio di concepire un figlio con trisomia 21 aumenta drasticamente con l’età della madre R.Lewis, ‘Genetica umana’, editore Piccin

FISH  Fluorescent in situ hybridazation Uso di una sonda di DNA specifica per una sequenza del cromosoma 21 R.Lewis, ‘Genetica umana’, editore Piccin

I principali tipi di anomalie di struttura dei cromosomi Per generare le anomalie di struttura sono necessarie rotture cromosomiche Conseguenze fenotipiche: per delezioni e duplicazioni dipendono dalla quantità e funzione dei geni coinvolti, per le inversioni dipendono dalla integrità o meno di geni importanti e da eventuali effetti di posizione R.Lewis, ‘Genetica umana’, editore Piccin

Due rotture sullo stesso cromosoma possono originare cromosomi con: Delezione interstiziale Inversione (paracentrica o pericentrica) Ad anello Strachan e Read, ‘Genetica molecolare umana’, editore Zanichelli

Inversione paracentrica i portatori di inversioni paracentriche producono 3 tipi di gameti: sbilanciati e instabili normali portatori dell’inversione Inversione paracentrica R.Lewis, ‘Genetica umana’, editore Piccin

Inversione pericentrica i portatori di inversioni pericentriche producono 3 tipi di gameti: sbilanciati normali portatori dell’inversione Inversione pericentrica R.Lewis, ‘Genetica umana’, editore Piccin

R.Lewis, ‘Genetica umana’, editore Piccin

TRASLOCAZIONE RECIPROCA Cromosomi NON omologhi vanno incontro a rottura e riunione e si scambiano un segmento cromosomico

R.Lewis, ‘Genetica umana’, editore Piccin

portatore di traslocazione reciproca bilanciata produce 4 tipi di gameti: 2 bilanciati e 2 sbilanciati gameti sbilanciati gameti bilanciati Zigoti normali o con traslocazione bilanciata o con monosomia e trisomia parziali +

TRASLOCAZIONE ROBERTSONIANA Fusione centrica tra due cromosomi acrocentrici che danno così origine ad un cromosoma metacentrico (se i due cromosomi che si fondono hanno uguali dimensioni) o submetacentrico (i due cromosomi che si fondono hanno dimensioni diverse). Il cromosoma che si viene a originare in tal modo è indicato con la sigla der (= derivato) 1 1 2 1 1 2 2 2

Il braccio corto dei cromosomi 13, 14, 15, 21 e 22 contiene i geni per i vari rRNA. La perdita di alcuni di essi in seguito alla traslocazione non comporta conseguenze fenotipiche

2 bilanciati e 4 sbilanciati 1 Portatore di traslocazione robertsoniana bilanciata – Produce 6 tipi di gameti: 2 bilanciati e 4 sbilanciati 1 2 2 gameti bilanciati gameti sbilanciati

zigote trisomico per il cromosoma 14 gameti bilanciati gameti sbilanciati Gameti sbilanciati fecondati da gameti normali produrranno zigoti monosomici o trisomici + Cromosoma 13 zigote trisomico per il cromosoma 14 Cromosoma 14