Introduzione Materiali e Metodi Risultati e Discussioni Bibliografia ANALISI GRAFICA DI SPETTRI DI ACIDI UMICI E FULVICI OTTENUTI MEDIANTE IONIZZAZIONE ELETTROSPRAY ACCOPPIATA ALLA SPETTROMETRIA DI MASSA CICLOTRONICA IN TRASFORMATA DI FOURIER Tummolo M.a, Lelario F.a, Scrano L.a, Senesi N.b, Bufo S.A.a a Dipartimento di Scienze dei Sistemi Colturali, Forestali e dell’Ambiente, Università degli Studi della Basilicata, Viale dell’Ateneo Lucano, 10 - 85100 Potenza b Dipartimento di Biologia e Chimica Agroforestale e Ambientale, Università degli Studi di Bari, Via Amendola 165/A, 70100 - Bari Introduzione Nonostante tecniche di indagine sempre più avanzate abbiano permesso di ottenere diverse informazioni sulle componenti della sostanza organica naturale (NOM), le attuali conoscenze sulla struttura chimica delle sostanze umiche sono ancora incomplete. La maggiore difficoltà incontrata nel definire la struttura chimica e la reattività di queste sostanze deriva dalla loro enorme eterogeneità chimica e variabilità di conformazione, insieme alla complessa varietà delle reazioni chimiche coinvolte nella loro sintesi e delle caratteristiche ambientali in cui si formano [1]. Negli ultimi anni, l’utilizzo della ionizzazione elettrospray (ESI), accoppiata ad un analizzatore di massa ad alta risoluzione a risonanza ciclotronica in trasformata di Fourier (FT-ICR), è risultato molto promettente nello studio delle sostanze umiche, in quanto la tecnica è in grado di fornire una visione d’insieme della composizione e dei dettagli in scala molecolare di miscele organiche complesse [2]. Tuttavia, gli spettri di massa FT-ICR della NOM risultano essere estremamente complicati, in quanto costituiti da un elevato numero di segnali, dove ogni segnale rappresenta un composto chimicamente distinto. Tale complessità ci pone di fronte ad un’interessante sfida nello studio degli spettri di massa al fine di una corretta interpretazione strutturale [3]. Metodi grafici bidimensionali, come quelli di Kendrick e di van Krevelen, sono stati applicati con successo all’interpretazione degli spettri di tali composti, permettendo di classificare i picchi in differenti serie omologhe sulla base dei range di massa [1]. Materiali e Metodi PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Gli standard di acidi umici e fulvici (Suwannee River, Nordic Aquatic e Soil) sono stati ottenuti dall’International Humic Substances Society. Gli acidi umici (1 mg) sono stati disciolti in 1 mL di una soluzione metanolo e acqua distillata 75:25 (v/v), con l’aggiunta di una piccola quantità di idrossido di ammonio 30%. Gli acidi fulvici (1 mg) sono stati disciolti in 1 mL di una soluzione composta da acqua distillata, isopropanolo e idrossido di ammonio 65,4:32,7:1,9 (v/v/v) [4]. Gli spettri di massa sono stati acquisiti mediante ionizzazione elettrospray (ESI) in negativo utilizzando uno spettrometro di massa ad alta risoluzione in trasformata di Fourier (Thermo LTQ FT, 7 Tesla). Dopo esser stati disciolti nelle rispettive soluzioni, i campioni di acidi umici e fulvici sono stati direttamente iniettati nello spettrometro di massa a 3 μL·min-1. Per ogni standard sono state effettuate 20 scansioni, ognuna composta da 100 microscansioni; la risoluzione applicata è stata di 100000. DIAGRAMMI DI KENDRICK E VAN KREVELEN Per valutare le differenze tra campioni differenti, oltre allo spettro che mostra la diversa intensità del segnale, si utilizzano elaborazioni grafiche che riescono a mettere in risalto le peculiarità dei campioni esaminati, anche perché l’assegnazione univoca della composizione elementare basandosi solo sull’alta risoluzione e sull’accuratezza dello strumento non è possibile per tutti i valori di massa. Per valori di massa superiori a 400-500 è necessario validare in maniera differente i risultati. Risultati e Discussioni Nei diagrammi di van Krevelen, ottenuti dall’elaborazione degli spettri di massa, si nota la presenza di alcune molecole che si dispongono lungo linee rette; questa disposizione può essere indicativa di relazioni strutturali tra famiglie di composti, causate da reazioni che interessano perdite o guadagni di gruppi funzionali. A titolo di esempio, nelle Figure 1 e 2 si riportano i diagrammi di van Krevelen e Kendrick ottenuti dall’elaborazione dello spettro di massa del solo standard di acido fulvico Suwannee River. Le linee, che identificano le serie omologhe, posseggono pendenze ed intercette che possono essere dimostrate matematicamente. Nella Tabella 1 sono riassunte le pendenze e le intercette delle suddette rette. Le serie omologhe di composti disposte lungo le linee A, B, C e D in Figura 1 sono state selezionate e ulteriormente analizzate in modo indipendente mediante l’analisi del difetto di massa di Kendrick [1]. Questo diverso approccio adottato nello studio dei diagrammi di van Krevelen e Kendrick ci ha permesso di identificare delle zone di maggiore interesse, la cui interpretazione ha reso possibile un confronto tra gli standard studiati. Tra gli acidi fulvici si è riscontrata una maggiore presenza di serie omologhe nei due standard estratti da acqua (Suwannee River e Nordic Aquatic) rispetto all’unico estratto da suolo (Soil), non ancora riportato in letteratura. In particolare, nei diagrammi di van Krevelen del campione di acido fulvico estratto dal suolo (Soil) si riducono notevolmente i segnali attribuibili alle serie omologhe relative ai processi di metilazione/demetilazione, idrogenazione/deidrogenazione, idratazione/deidratazione ed ossidazione/riduzione, che risultano più abbondanti negli altri due campioni. Negli standard di acidi umici, le differenze riscontrate non sono così evidenti per tutte le serie omologhe individuate. Tabella 1. Caratteristiche delle linee delle stesse serie omologhe nel Diagramma di van Krevelen Reazioni chimiche Caratteristiche delle linee Metilazione/demetilazione (A) b = 2 Idrogenazione/deidrogenazione (B) linea verticale Idratazione/deidratazione (C) a = 2 Ossidazione/riduzione (D) a = 0; b = 2 a e b rappresentano rispettivamente la pendenza e l’intercetta di una linea dall’equazione H/C = - a(O/C) + b Figura 1. Diagramma di van Krevelen calcolato dallo spettro di massa dell’acido fulvico Suwannee River Figura 2. Analisi del difetto di massa di Kendrick delle serie omologhe identificate in Figura 1 nel campione di acido fulvico Suwannee River: a) linea A, b) linea B, c) linea C, d)linea D Kim S., Kramer R. W., Hatcher P. G. (2003); Analytical Chemistry, 75: 5336 Kujawinski E. B., Hatcher P. G., Freitas M. A. (2002); Analytical Chemistry, 74: 413 Koch B. P., Dittmar T. (2006); Rapid Communication in Mass Spectrometry 20: 926 Stenson A. C., Marshall A. G., Cooper W. T. (2003); Analytical Chemistry, 75: 1275 Bibliografia