MARCATURA ISOTOPICA Radioisotopi più usati per marcare gli acidi nucleici Isotopo Emivita Tipo di emissione Energia di emissione 3H 12.4 anni beta - 0.019 MeV 32P 14.3 giorni beta - 1.710 MeV 33P 25.5 giorni beta - 0.248 MeV 35S 87.4 giorni beta - 0.167 MeV Marcatura con 3H :nucleotide con isotopo in posizioni diverse Marcatura con 32P, 33P: nucleotidi con l’isotopo nel gruppo fosfato in  (marcatura interna); un nucleotide con l’isotopo nel gruppo fosfato in  che viene sostituito dal P del nucleotide terminale (marcatura terminale con chinasi) Marcatura con 35S: inserito nucleotide con l’isotopo 35S al posto dell’O- del gruppo fosfato in posizione 

MARCATURA INTERNA DEL DNA MEDIANTE “RANDOM PRIMING” Klenow: subunità della DNA polimerasi I di E.coli. Attività endonucleasica 5’ 3’ no esonucleasica 5’ 3’ (distruggerebbe primer) si esonucleasica 3’ 5’

MARCATURA INTERNA DEL DNA MEDIANTE “RANDOM PRIMING”

MARCATURA TERMINALE DEL DNA MEDIANTE POLINUCLEOTIDE CHINASI

MARCATURA NON ISOTOPICA - Diretta: incorporazione di nucleotidi modificati contenenti un fluoroforo (gruppo chimico che emette fluorescenza se esposto a certe lunghezze d’onda) - Indiretta: incorporazione di un nucleotide al quale è stato legato un gruppo indicatore (R); individuazione dell’ibridazione della sonda per riconoscimento di (R) da parte di un “anticorpo” (A) che viene evidenziato con un marcatore (M) Digossigenina (steroide vegetale) e biotina (vitamina B7) hanno un gruppo indicatore (incorporato nell’acido nucleico) che può essere riconosciuto da ligandi specifici. Esempi: La biotina viene legata dall’avidina (glicoproteina presente nell’albume dell’uovo) legata a marcatore fluorescente saggio fluorimetrico; La digossigenina viene legata da un anticorpo monoclonale coniugato con la fosfatasi alcalina saggio enzimatico con conversione di un substrato incolore

Fluorofori per la marcatura non isotopica diretta dUTP Fluorescin-dUTP (verde) Rhodamine-dUTP (rosso)

Marcatura non isotopica indiretta

Marcatura non isotopica indiretta Deossiuridina trifosfato (dUTP) modificata con Biotina, ibridazione con Avidina accoppiata con marcatore fluorescente Marcatura non isotopica indiretta Sonda DNA complessata con perossidasi di rafano (Horseradish peroxidase, HP) + luminolo: sviluppo di chemioluminescenza rilevata con autoradiogramma

Utilizzo delle sonde marcate per: Ibridazione degli acidi nucleici: DNA, RNA Southern blot (in genere: marcatura isotopica) Northern blot (in genere: marcatura isotopica) Ibridazione di filtri con colonie (in genere: marcatura isotopica) Ibridazione in situ di cromosomi per mappatura citogenetica (ora non isotopica) Ibridazione in situ di tessuti (ora non isotopica) Ibridazione di filtri con spot di DNA da PCR (dot blot)

Ibridazione con una sonda molecolare

Ibridazione con una sonda molecolare

IBRIDAZIONE DI UN SOUTHERN BLOT Specificità dell’ibridazione: Temperatura di ibridazione Concentrazione salina Temperatura lavaggi

IBRIDAZIONE DI UN NORTHERN BLOT

IBRIDAZIONE DI FILTRI CON COLONIE

Preparazione di sonde marcate di RNA: Riboprobes

IBRIDAZIONE IN SITU su campione intero Espressione di un gene per la crescita dei fibroblasti nell’embrione di pollo. Trascritti marcati con sonda antisenso marcata con digossigenina e rilevati con anticorpi antidigossigenina accoppiati a fosfatasi alcalina

IBRIDAZIONE DI SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE SU DOT BLOT

MAPPATURA CITOGENETICA CON IBRIDAZIONE IN SITU DI SONDE MARCATE Procedura sperimentale: Mitosi fissate su vetrino Parziale deproteinizzazione con proteasi Denaturazione ad alte temperature (90-100°C) Ibridazione con sonda denaturata e marcata con isotopo radioattivo (o colorante fluorescente) Lavaggi Esposizione con lastra autoradiografica e sviluppo se sonda radioattiva Svantaggi dell’uso di tritio: Utilizzo del radioattivo Bassa risoluzione (diffusione della radiazione ed alto background) Bassa sensibilità

MAPPATURA CITOGENETICA CON IBRIDAZIONE IN SITU

MAPPATURA CITOGENETICA CON IBRIDAZIONE IN SITU Localizzazione diretta di sonde su cromosomi metafasici Posizionamento contemporaneo di più sonde lungo i cromosomi Localizzazione di sonde rispetto a bande e strutture conservate (centromeri e telomeri)

Ibridazione in situ fluorescente Fluorescent In Situ Hybridization: FISH Ibridazione in situ fluorescente - Metodo diretto: Marcatura della sonda con nucleotidi coniugati a fluorocromi - Metodo indiretto: Riconoscimento della sonda con una seconda sonda marcata con fluorocromi Visualizzazione diretta al microscopio a fluorescenza FISH SU CROMOSOMI METAFASICI (Risoluzione 1 Mb) FISH SU CROMOSOMI INTERFASICI (Risoluzione tra 500-50 Kb) - FISH SU CROMOSOMI IN INTERFASE ARTIFICIALE (700 - 5 Kb) (Fiber FISH)

MICROSCOPIA A FLUORESCENZA dUTP Fluorescin-dUTP (verde) Rhodamine-dUTP (rosso)

FISH Ibridazione con sonda che copre il sito di rottura cromosomica

FISH MULTICOLORE - Utilizzo sostanza fluorescenti con diverso spettro di emissione (FITC, fluorescina isotiocianato, Texas Red, rodamina) - Utilizzo contemporaneo di sonde marcate con diversa localizzazione lungo il cromosoma

FISH MULTICOLORE

CHROMOSOME PAINTING - Sonde: collezione di frammenti specifici di ogni cromosoma - Ogni cromosoma risulta fluorescente ed ha un colore diverso - Utilizzo di un microscopio a fluorescenza ed analisi digitale dell’immagine - Cariotipo molecolare (spectral karyotype SKY)

FISH MULTICOLORE Sonde: collezione di frammenti specifici di un singolo cromosoma Cromosomi fluorescenti con colori diversi Utilizzo di un microscopio a fluorescenza ed analisi digitale dell’immagine

Chromosome painting FISH multicolore