Necessità di ottenere ambienti, recipienti, soluzioni privi di microbi (o con cariche microbiche ridotte, senza microbi ‘indesiderati’; metodi fisici o chimici) Pratiche tradizionali (settore alimentare): Calore Salatura Affumicatura Essiccamento Pastorizzazione Pratiche sanitarie: Sterilizzazione: uccisione (o rimozione) di tutte le forme viventi, comprese endospore e virus Disinfezione: uccisione delle forme vegetative dei patogeni Sanitizzazione: riduzione della concentrazione di forme patogene fino a basso livello di rischio in oggetti, superfici ed ambienti pubblici Asepsi: disinfezione chimica di tessuti viventi

Uso del calore Calore secco (stufa, >2h a 180°C, materiale secco) Calore umido (autoclave, 20’ a 121°C, terreni) Bollitura (100°C: non sterile, virus e spore sono resistenti) Pastorizzazione (non sterile)

Sterilizzazione con AUTOCLAVI

Pasteurizzazione del latte (anche vino, birra, succhi di frutta): riscaldamento a 60-65°C per 10-30’’ – riduce la carica microbica da circa 10.000 a 1.000 germi/ml e induce uno shock termico nei batteri che sopravvivono – non inattiva le fosfatasi – altri effetti dipendenti dal grado di danneggiamento termico: perdita gas disciolti, coagulazione sieroproteine, precipitazione caseinato di calcio (maggiore quanto maggiore è l’acidità) precipitazione sali di calcio, idrolisi parziale della lecitina, distruzione Vit. C, Vit. A ed enzimi, variazioni di sapore Impianto di pasteurizzazione

Altri metodi di Pasteurizzazione: High Temperature Short Time Pasteurization (HTST): il latte viene trattato a 75°C per 15 secondi; minori conseguenze organolettiche. Pasteurizzazione classica e HTST NON sterilizzano – tarati su Mycobacterium tubercolosis Ultra High Temperature (UHT): il latte viene trattato a 140°-150° C per 3 -1 secondi e poi raffreddato rapidamente sotto vuoto, il latte UHT a lunga conservazione: 120° per 30’

FILTRAZIONE ioni molecole macro- microrganismi

Tre tipi di radiazioni sono battericide: Radiazioni ionizzanti: raggi X e gamma, fasci elettronici (bassa lungheza d’onda) Allontanano gli elettroni dagli atomi formando ioni. Causano mutazioni al DNA e formano perossidi. Utilizzate per sterilizzare materiale medico-farmaceutico, libri ed alimenti (patate, cipolle) Svantaggi: penetrano nei tessuti e provocano mutazioni. Luce UV (radiazione non-ionizzante): lunghezza d’onda 240-280 nm. Danneggia il DNA e causa mutazioni Usate per disinfettare camere operatorie, camere sterili, camere neonatali. Svantaggi: Danneggia occhi e pelle. Non penetra la carta, vetro e abiti. Microonde: non molto efficienti come radiazioni battericide. Lunghezza d’onda da1 millimetro a 1 metro. Può uccidere per riscaldamento cellule contenenti acqua (forme vegetative). In pratica equivale alla bollitura. Le endospore batteriche, che non contengono acqua, non vengono danneggiate.

Sensibilita’ agli UV: sopravvivenza Dosaggio UV

Metodi Chimici Definiti complessivamente Disinfezione, solo in qualche caso si tratta di Sterilizzazione – uccidono potenziali patogeni – uso principale: prevenzione Valutazione efficacia: Disk-diffusion method – osservazione di aloni di inibizione della crescita di microrganismi test

Fenolo e composti fenolici Primo disinfettante usato (Lister, 1800) Denaturano proteine Distruggono membrana cellulare Lunga persistenza Uso non più attuale (Fenolo: irritante) Derivati usati in trattamenti infezioni orali

Alogeni Iodio in soluzione alcolica (I2 7%, KI 5%, Alcohol 85% = Tintura di iodio): uno dei primi disinfettanti usati e, ad oggi, ancora uno dei più efficaci battericida capace di uccidere anche le spore leggermente irritante trattamenti esterni, ferite Iodina le tirosine e, come conseguenza, denatura le proteine Cloro: usato come gas (Cl2) o come soluzione di Sodio ipoclorito (NaClO) Disinfettante e sanitizzante per acque Inattivato da composti organici Ossidante Uso diffuso e storico

Alcoli: soluzioni intorno al 70% denaturano proteine e agiscono come solventi nei confronti delle membrane battericidi e fungicidi non attivi su spore e poco su virus volatili, poco permanenti spesso in associazione con altre molecole attive (tintura di Iodio) Ossido di etilene: sterilizzante denatura proteine reagendo con (o sostituendo) i gruppi funzionali laterali degli aminoacidi gassoso al di sopra di 10,7° C usato in contenitori tipo autoclave senza riscaldamento uso complesso (tossico, esplosivo) materiali ospedalieri sensibili al calore, libri

Terreni che permettono la crescita di microrganismi specifici: concetto di terreno selettivo e disegno del terreno: uso di inibitori della crescita per selezionare organismi resistenti (es. Antibiotici) uso di particolari fonti di carbonio o azoto uso di terreni a composizione particolare, es terreni ad alta osmolarita’ pH temperatura aerazione (ossigeno) Come operare: Isolamento diretto su piastre selettive (separazione fisica sulla superficie) Arricchimenti per trasferimenti successivi di aliquote (competizione libera in liquido)

Limitazione attività metabolica Ottenibile mediante riduzione della temperatura oppure mediante rimozione, parziale o totale, dell’acqua cellulare; meno frequentemente mediante limitazione della disponibilità di nutrienti. Essiccamento Metodo efficiente, usato da oltre 100 anni. La terra è l’habitat naturale della grande maggioranza dei microrganismi; sterilizzata, è utilizzata per lo stoccaggio a T ambiente di bacilli (aerobi), clostridi (anaerobi), actinomiceti e funghi, sia come spore che come cellule vegetative, anche per lieviti e batteriofagi. Actinomiceti sopravvivono oltre 20 anni se disidratati in terreno. Usato anche il gel di silice (previa sterilizzazione ed essiccamento). La conservazione viene aumentata se la temperatura di stoccaggio è tenuta a 4° C e sotto atmosfera controllata (Azoto) o condizioni di vuoto parziale. Liofilizzazione Microrganismi sospesi in mezzo con agenti protettivi, spesso proteine del latte, sono congelati velocemente e l’acqua viene poi rimossa per sublimazione sotto vuoto spinto. I recipienti sono quindi riempiti di gas inerti (Argon, Azoto) e sigillati, stoccaggio in genere a 4° C. Sopravvivenza minimo 10 anni. Congelamento Uno dei metodi elettivi per la conservazione di ceppi industriali; adatto anche per linee cellulari. Utilizzato sia per cellule vegetative che spore. Ad una coltura liquida viene aggiunto il 10 -15 % di agente crioprotettivo (in genere glicerolo, talvolta con piccole quantità di lattosio, maltosio). Il recipiente sigillato viene immerso in azoto liquido, poi conservato a -80° C. Questa procedura minimizza i danni causati dalla formazione di cristalli di ghiaccio endocellulari. Altri sistemi Colture su agar slants (con passaggi meno frequenti possibile) sono mantenute a 4° C oppure sotto olio sterile a T ambiente per lunghi periodi. Particolarmente adatto per funghi (Mucor, Penicillium, Aspergillus) per i quali sono possibili intervalli di 4 anni tra un passaggio e l’altro.