Antibiotici

DEFINIZIONE DI ANTIBIOTICO Per antibiotico si intende una molecola naturale, metabolita secondario di Eubatteri, Actinomiceti e Funghi inferiori, prodotta in coincidenza della differenziazione di strutture cellulari specializzate per la sopravvivenza microbica quando il substrato è esaurito

Produzione di sostanze antibiotiche indotta dalla carenza di metaboliti azotati ESAURIMENTO SUBSTRATO CRESCITA PRE-SPORULAZIONE CRESCITA POST-LOGARITMICA LISI CRESCITA ESPONENZIALE SPORE DEPRESSIONE CATABOLICA ANTIBIOTICI ESOENZIMI ESOTOSSINE Bacillacee Actimomiceti Funghi inferiori

Attinomiceti produttori di antibiotici Streptomiceti Actinomicina Amfotericina Bleomicina Cloramfenicolo Eritromicina Kanamicina Josamicina Midecamicina Mitomicina Neomicina Nystatina Paromomicina Rifamicina Spiramicina Streptomicina Tetracicline Tobramicina Viomicina Adicillina* Cefamicina C** Nocardicina A Acido clavulanico Tienamicina Carpetimicina Micromonospora Gentamicina Nocardia Ristocetina Vancomicina * Penicillina N (prodotta anche da funghi aspergillali) ** Inibitori competitivi di beta-lattamsi

Miglioramento dei ceppi produttori di antibiotici 1) Mutagenesi random uso di radiazioni ionizzanti o agenti mutageni (NTG nitrosoguanidina) ottimizzazione dei protocolli di uso: mortalità tra 60-90% coincide con la massima frequenza di mutazioni puntiformi 2) Approccio molecolare (gene-specifico) identificazione dei geni codificanti la via biosintetica analisi flussomica ed identificazione degli steps lenti sovra-produzione degli E che catalizzano gli steps lenti o introduzione di nuovi catalizzatori nuovi prodotti! I ceppi industriali attuali risultato di circa 50 anni di miglioramenti Le percentuali di miglioramento diminuiscono con gli anni! Significativi anche miglioramenti ≥ 5%

Penicillum chrysogenum L’applicazione della tecnica di mutazione e selezione al problema della produzione di penicillina… Penicillum notatum resa: 0.6-1.2 mg PenG/litro di coltura Penicillum chrysogenum resa: 1-2 mg PenG/litro di coltura Mutante spontaneo Penicillum chrysogenum resa: 120 mg PenG/litro di coltura Addizione agenti mutageni Selezione di mutanti superproducenti Ceppo Wisconsin Ulteriori cicli mutazione/selezione Ceppi attuali in uso Penicillum chrysogenum resa: 10-50 g PenG/litro di coltura

Approccio molecolare Biosintesi, geni ed enzimi coinvolti nella produzione dei -lattami In P.chrysogenum sono stati introdotte copie extra del gene che codifica per la ciclsi (pcbC) e l’aciltransferasi (pen DE)

Selezione ceppi migliorati Miglioramento dei ceppi produttori di antibiotici Selezione ceppi migliorati Schema di lavoro La valutazione del miglioramento è fatta in beuta Le performance produttive possono cambiare considerevolmente in fermentatore da produzione!

Lo scale-up produttivo è l’aspetto critico per la validazione del ceppo migliorato

Ottimizzazione del processo fermentativo con fed-batch Le fasi del processo di fermentazione Massima produttività volumetrica Minore tempo di turn around (tempi di fermata) per i fermentatori di produzione Produttività = R/ t + tempo di fermata Uso di treni di fermentatori di volume crescente per un veloce aumento della biomassa (1-5% volume successivo) Terreni di coltura semplici nelle fasi di amplificazione Carboidrati facilmente assimilabili Ottimizzazione del processo fermentativo con fed-batch

Olio aggiunto anche per controllare la schiuma ed il sollevamento da aria

L’importanza della modalità di fermentazione Parametri controllati DOT (produttori aerobi) CO2 disciolta Flusso di aria Aumento della pressione nel vessel

La penicillina originaria era una miscela di numerose e diverse penicilline che differivano per la catena laterale R La prima penicillina pura prodotta è stata la PenG, ancora oggi in produzione L’altra penicillina prodotta unicamente per fermentazione è oggi la PenV (R=acido fenossiacetico) Tutte le altre penicilline oggi in produzione sono derivate da PenG o PenV per successiva sintesi organica (penicilline semi-sintetiche)

La produzione del precursore (6-APA) delle penicilline semi-sintetiche La conversione della Pen in 6-APA è catalizzata dalla penicillina acilasi immobilizzata! 6-APA (acido 6-aminopenicillanico) è il precursore delle penicilline semi-sintetiche

In assenza, le cellule non sono in grado di produrre penicillina Il controllo della somministrazione di fonti di carbonio determina il successo del processo! In assenza, le cellule non sono in grado di produrre penicillina In eccesso, la sintesi dei metaboliti secondari è inibita

Nel corso del processo di produzione della penicillina G con P Nel corso del processo di produzione della penicillina G con P.chrysogenum la fase batch dura circa 40 ore poi viene attaccata l’alimentazione fed-batch in moda da mantenere  molto bassa . Nel suo insieme il processo dura 120-200 ore. Data la stabilità dei ceppi produttori si può usare anche il repeated fed-batch

Il processo di purificazione della penicillina Separazione del brodo dal micelio Raffreddamento del brodo a 0-3°C Acidificazione a pH 2-3 con H2SO4 Estrazione contro-corrente con butilacetato (20%v/v). Fase acquosa scartata! Neutralizzazione (+NaOH o KOH) II estrazione e rimozione del prodotto dalla fase organica sotto forma di sale RCOOH RCOO- Na+ +H2O Recupero del butilacetato Cristallizzazione