Microbiologia Enologica UNIVERSITÁ DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II FACOLTÀ DI AGRARIA CORSO DI LAUREA IN VITICOLTURA E ENOLOGIA DIPARTIMENTO DI AGRARIA Sezione di Scienza della Vite e del Vino Corso di Microbiologia Enologica Condizioni di sviluppo dei lieviti vinari

Sviluppo di microrganismi indesiderati Arresti di fermentazione Il mosto d’uva è un substrato facilmente fermentescibile Glucidi: glucosio e fruttosio Acidi organici: tartarico, malico e citrico Cationi minerali: potassio, calcio, magnesio Composti azotati: NH4+, aminoacidi, polipeptidi e proteine Fattori di crescita: vitamine Fattori di sopravvivenza Un inoculo di circa 106 cellule/ml garantisce un regolare svolgimento della FA Fattori che influenzano la cinetica di crescita dei lieviti ed il decorso della FA - di natura chimica: carenze nutrizionali, presenza di inibitori - di natura chimico-fisica: ossigenazione, temperatura, chiarificazione - di natura antagonistica: lievito-lievito, lievito-batteri In funzione di questi fattori la fermentazione si svolgerà più o meno bene Sviluppo di microrganismi indesiderati Arresti di fermentazione

Monitoraggio della fermentazione alcolica Conteggio dei microrganismi Camere di conta (conta totale) Torbidità (conta totale) Metodo UFC (Conta vitale) Epifluorescenza (Conta vitale) ATP per bioluminescenza (Conta vitale) Più alta nella massa delle vinacce rispetto al fondo Effettuare la misura dopo rimescolamento della massa Controllo della cinetica di fermentazione - misura della temperatura - stima del decorso della fermentazione: -- zuccheri consumati -- alcol formato -- CO2 svolta -- massa volumica (densità) Tracciare un grafico Misura della quantità di zuccheri presenti nel mosto Relazione zuccheri consumati-->alcol prodotto (circa 16,83 g/L di zuccheri consumati --> 1% alcol prodotto) Prelievi a metà altezza del tino di fermentazione (assaggiavino) Vinificazione in rosso miscelare prima di effettuare il prelievo

Esercitazioni 2014-15

A e B mosti vinificati in rosso 1,085 * 30-32 °C Massa volumica Temperatura (°C) T (°C) B 1,005 * 17-18 °C 0,995 A Tempo in giorni A e B mosti vinificati in rosso

°Brix Temperatura Fermentazione 2010

Fermentazione 2009

Automazione delle fermentazioni si basano sul controllo della temperatura accoppiati a dispositivi di riscaldamento/raffreddamento Controllo della CO2 svolta Modello di svolgimento della fermentazione Vinificazione in rosso inizio fermentazione 18-20 °C (crescita) fine fermentazione anche > 30 °C (estrazione dalle vinacce) La prevenzione della formazione della schiuma Schiuma comporta uno sforzo tecnologico in termini di vasi vinari composizione del mosto (sostanze proteiche) (bentonite) temperatura di fermentazione ceppo (selezionare ceppi a basso potere schiumogeno) Impiego di tensioattivi (mono e di-gliceridi dell’acido oleico) Dosi di 10 mg/L --> non lasciano residui nel vino specialmente dopo la filtrazione --> permettono di riempire i contenitori anche al 75-80 (VR); 85-90% (VB)

B) Stazionaria circa 8 gg Crescita 2-5 gg (inoculo-naturale) B) Stazionaria circa 8 gg C) Declino Zucchero fermentato 4-5 generazioni Non c’è proporzione fra le fasi La cinetica di fermentazione È collegata la ciclo di crescita Declino: il lievito sopravvive Difficoltà di trasporto attraverso la membrana Capacità di crescita/sopravvivenza Lieviti totali Lieviti vitali A B C

Arresti di fermentazione Temperature elevate Conc. zuccheri elevate Conc. elevate di etanolo Carenze nutrizionali Fenomeni di inibizione Altri………. Azione sulla crescita e sulla sopravvivenza Azioni sulla crescita Azioni sulla sopravvivenza Azione sulla crescita

Fabbisogni nutrizionali: le fonti di carbonio Zuccheri del mosto (glucosio e fruttosio) 170-220 g/L (vini con grado alcolico 10-13 %) anche 350 g/L (vini dolci e liquorosi) Crescita: lenta a circa 1 g/L aumenta progressivamente fino a 15-20 g/L si stabilizza fra 20-200 g/L per conc. > di 200 g/L rallenta il mosto contenete 600-650 g/L è infermentescibile Può capitare che si ottiene più alcol da un mosto che contiene una percentuale di zucchero inferiore Nei vini dolci liquorosi la stabilità microbiologica è assicurata dall’azione combinata di alcol e zucchero Correzione dei mosti: zuccheraggio è consigliabile effettuarlo al secondo giorno dall’inizio della fermentazione - il lievito si sviluppa ad una conc. di zuccheri relativamente più bassa - lieviti in piena attività, attività fermentativa alta, concentrazione di etanolo bassa - dopo l’aggiunta si può prevedere un repentino aumento della temperatura

Fabbisogni nutrizionali: le fonti di azoto Mosto 0,1-1,0 g/L di azoto solubile NH4+ 3-10 % amminoacidi 25-30 % polipeptidi 25-40 % proteine 5-10% Varietà, Portainnesto Condizioni pedoclimatiche Concimazioni Grado di maturazione Presenza di muffe Carenze idriche Condizioni di vinificazione Torchiatura lenta Macerazione > azoto ammoniacale utilizzabili Non utilizzabili Fonte prontamente utilizzabile e può soddisfare tutte le esigenze azotate (azoto prontamente assimilabile- APA Miscele di sali di ammonio ed amminoacidi possiedono un’efficacia eccellente nello stimolare la crescita e la velocità di fermentazione

La maggior parte degli aa sono assimilati durante la fase esponenziale

Fabbisogni nutrizionali: sali minerali Fosfato diammonico (casse ferrica) Solfato diammonico Dose normale 10-20 g/hl Regolamento CE max 30 g/hl 10g/hl di sale di ammonio aumenta l’acidità del mosto di 0,52 g/hl (ac. Tartarico) Residui nel vino Minore prod. di alcoli superiori Carbammato di etile Il contenuto iniziale di NH4+ è essenziale < 25 mg/L arricchimento necessario 25-50 mg/L arricchimento consigliato > 50 mg/L arricchimento controindicato L’arricchimento in azoto (o di qualsiasi altro attivatore) ha un effetto positivo sulla crescita ma non sulla sopravvivenza (curva II, diapositiva 8) Effetto positivo della temperatura e dell’ossigenazione sull’assimilazione dell’N La massima efficacia si ottiene aggiungendo il sale di ammonio a metà fermentazione con aerazione simultanea Fabbisogni nutrizionali: sali minerali Si può considerare che il mosto contenga minerali sufficienti (quantità e qualità) per sostenere la crescita dei lieviti

APA Azoto Prontamente Assimilabile (numero di formolo) Ci si riferisce all’azoto assimilabile del lievito, considerato la somma dell’azoto ammoniacale più l’azoto da amminoacidi (amminico). L’amminoacido prolina pur essendo quantitativamente il più importante non viene normalmente utilizzato dal lievito e fortunatamente il procedimento lo esclude dal dosaggio. Al momento della preparazione del vino per una rifermentazione può essere interessante conoscere il contenuto in azoto assimilabile. La regolamentazione CEE consente soltanto un’aggiunta di azoto ammoniacale (come ione ammonio NH4+) sotto forma di fosfato biammonico e solfato ammonico (max 0.3 g/l) e di bisolfito e solfito di ammonio (max 0.2 g/l): se si impiegano in mescolanza il massimo impiegabile è 0.3 g/l. Principio del metodo La formalina aggiunta al vino blocca le funzioni amminiche basiche degli amminoacidi e permette quindi la titolazione della funzione acida degli stessi con una normale titolazione acidimetrica. Come indicatore si impiega la fenolftaleina o meglio un pH-metro. L’anidride solforosa presente va eliminata per ossidazione con acqua ossigenata.

Materiali e reagenti pH-metro, agitatore magnetico Bicchieri da 150 ml, forma alta e da 100 ml. Formalina, 40% di formaldeide. Sodio idrato 0.1N Sodio idrato 4N Acqua ossigenata 33 vol. Modo di operare 50 ml di formalina posti in piccolo bicchiere vengono portati a pH 8.3 per aggiunta di NaOH 0.1 N al pH-metro o al rosa della fenolftaleina. 50 ml del vino in esame, decarbonicato almeno per agitazione se in fermentazione, versati in bicchiere da 150 ml, vengono aggiunti di due gocce di acqua ossigenata 33 vol e portati a pH 8.3 al pH-metro o al viraggio della fenolftaleina per aggiunta di gocce di NaOH 4N e verso la fine con NaOH 0.1 N. L’operazione si esegue comodamente ponendo il bicchiere, con ancoretta, su agitatore magnetico. Non è necessario che il pH 8.3 sia stato controllato esattamente in precedenza, purché nella successiva titolazione ci si arresti a questo stesso valore. Si aggiungono al vino i 50 ml di formalina prima preparati, si omogeneizza, si attende 1 minuto circa; il pH scende e quindi si titola, lentamente verso la fine, con NaOH 0.1N sino a raggiungere pH 8.3. Si annotano i millilitri impiegati in quest’ultima titolazione.

Numero di formolo meq/l = NaOH 0.1N x 2 Azoto assimilabile mg/l = numero di formolo x 14 = ml NaOH 0.1N x 28 I valori normalmente riscontrati nei Mosti: numero di formolo 10-30 (azoto assimilabile 150 – 400 mg/L) Vini: numero di formolo 4-18 (azoto assimilabile 50-250 mg/l). Concentrazione di riferimento in fermentazione: 75 mg/L APA per ogni 100 g/L zuccheri riducenti

Fabbisogni nutrizionali: fattori di crescita Agiscono (a bassa concentrazione ) sulla moltiplicazione e le attività cellulari Sono ben rappresentate nel mosto Carenza di acido pantotenico -->(carenze lipidiche ?) accumulo di acido acetico Aggiunta di tiamina (max 50 mg/hl) aumenta la vitalità delle cellule del 30 % e diminuisce la quantità di chetoacidi

Fabbisogni nutrizionali: fattori di sopravvivenza Modalità d’azione degli steroli e di certi acidi grassi a lunga catena sull’attività dei lieviti e sul decorso della fermentazione Steroli indispensabili in anaerobiosi: non possono essere sintetizzati ed assicurano la permeabilità della membrana La FA di grandi volumi (anaerobiosi) Rimontaggi Inoculo con lieviti selezionati Popolazioni epifite e di cantina Nozione fattore di sopravvivenza Ergosterolo Molto importanti per prevenire gli arresti di fermentazione Ergosterolo Aggiunta di ergosterolo e acido oleanolico Non influisce sulla crescita Fase di declino meno repentina Stesso effetto aerazione e presenza di bucce

Fabbisogni nutrizionali: altri attivatori della fermentazione In relazione ad una migliore utilizzazione delle fonti di azoto Estratti di lievito idrolizzati (fattori di crescita, azoto assimilabile, sali) dose fino a 4 g/L, possono conferire odore e gusto anomali - STPB (200 mg/L) solfato diammonico 100 g tiammina 250 mg pantotenato di calcio 250 mg biotina 2 mg - Prodotti di origine fungina: da Aspegillus niger e Botrytis cinerea - Fecce nei vini bianchi secchi

Inibitori della fermentazione: etanolo L’etanolo agisce negativamente sui sistemi di trasporto attivo e rallenta l’assimilazione delle sostanze azotate L’etanolo ha sempre un effetto inibente anche a bassa concentrazione (è difficile far ripartire una fermentazione bloccata) La quantità che blocca la FA è funzione ceppo, temperatura, ossigeno

Inibitori della fermentazione: sottoprodotti della fermentazione Nel corso della FA, oltre all’etanolo, possono formarsi delle sostanze che hanno un effetto inibente sui lieviti - queste sostanze sono eliminate dal carbone - buona ripresa di fermentazioni bloccate dopo trattamento con carbone - sono acidi grassi saturi C6, C8, C10 (alcuni mg/L nel vino) caproico, caprilico, caprico - agiscono negativamente sulla permeabilità della membrana (trasporto zuccheri) - impiego delle scorze di lievito: adsorbono gli acidi grassi inibitori, apportano steroli e acidi grassi insaturi a lunga catena, ripristinano la permeabilità della membrana 10-7 scorze di lievito: sostituti dell’ossigeno, fattori di sopravvivenza

Dati sperimentali mostrano la superiorità delle scorze di lievito rispetto alle aggiunte di sali di ammonio. A fine fermentazione le cellule totali aumentano di poco quelle vitali sono in maggior numero aumenta lo zucchero fermentato Momento più opportuno per l’aggiunta meglio dopo la fase di crescita (4-5° giorno) Particolarmente utili in caso di mosti ricchi di zuccheri con residui di pesticidi temperature elevate Il loro utilizzo comporta, spesso, variazione nella concentrazione di prodotti secondari (alcoli superiori, acidi grassi e loro esteri) che possono modificare l’aroma (specialmente in vini con struttura semplice) In questi casi preferire interventi che hanno effetti simili (temperatura, aerazione, aggiunta di sali di ammonio)

Inibitori della fermentazione: sostanze di varia origine Fungicidi, quelli solforati o clorurati hanno una spiccata attività anti-lievito Tannini, in alcune varietà sono molto rappresentati (si fissano sulle pareti cellulari) CO2, i lieviti riescono a resistere fino a 7 bar (spumanti) Sviluppo prematuro di batteri, spesso consegue un arresto di fermentazione Presenza di Botrytis cinerea (botriticine) influenza la cinetica di fermentazione e favorisce la formazione di acido acetico e glicerolo

Fattori fisico-chimici: temperatura Dalla FA del glucosio si producono 2 ATP (14,6 kcal) --> 25,4 kcal si dissipano come calore Se si fermenta un mosto contenete 180 g/L di glucosio (una mole) si produrranno in totale 25,4 kcal la temperatura della massa dovrebbe aumentare di circa 25 °C (20 °C-->45°C) Fortunatamente la FA si svolge in diversi giorni (2-3 settimane) il calore ha il tempo per disperdersi: moti convettivi alimentati dalla CO2 raffreddamento dovuto all’evaporazione di H20 ed etanolo scambio attraverso le pareti del tino di fermentazione La temperatura di un mosto in fermentazione è condizionata da vari fattori tenore in zuccheri temperatura iniziale velocità di fermentazione (> velocità < dispersione) dimensioni dei tini materiale dei tini (K, cal/h/m2 per ∆°C; acciaio>legno>cemento) arieggiamento e temperatura della cantina

La temperatura accelera la fermentazione ma comunque la limita Nella vinificazione in rosso temperature 25-30 °C sono necessarie, nel corso della macerazione, per avere un buona estrazione delle sostanze fenoliche dalle parti solide (termoregolazione solo in alcuni casi) Le vinificazioni in bianco devono essere condotte a < 20 °C (refrigerazione) I lieviti, S. cerevisiae in particolare, sono in grado di crescere tra 10 e 30 °C L’attività fermentativa raddoppia ogni 10 °C è massima a 30 °C diminuisce a 40 °C Tra 15 e 30 °C la fase di latenza è più corta quanto più alta è la temperatura La fermentazione dello zucchero è due volte più rapida a 30°C rispetto a 20 °C Mosti con elevato contenuto di zuccheri Stress termici Condizioni ottimali (Vinif. Rosso) fase di crescita 18-20 °C fase finale 30-32 °C La temperatura accelera la fermentazione ma comunque la limita

Fattori fisico-chimici: ossigeno Degradazione degli zuccheri--> fermentazione --> respirazione-->vini sotto velo, lieviti fioretta La denominazione “la vita senza aria” (Pasteur) non è applicabile nella FA Lo sviluppo dei lieviti e la FA in è possibile in assenza completa di aria Il ruolo dell’ossigeno nella FA è considerevole L’introduzione di ossigeno è lo strumento più efficace per controllare e monitorare la fermentazione vini rossi, rimontaggi vini bianchi, generalmente non si fanno per paura di ossidazioni (è giusto?) I lieviti in fermentazione hanno una eleva capacità di assorbire ossigeno Gli aromi del mosto prima della fermentazione e dei vini bianchi dopo allontanamento delle fecce sono facilmente ossidabili Gli aromi del mosto in fermentazione non sono influenzati dall’ossigeno

Accelerazione della fermentazione per aerazione maggiore consumo di composti azotati maggiore sintesi di steroli ed acidi grassi insaturi maggiore ingresso di glucidi L’influenza è tanto più marcata quanto maggiore è la quantità introdotta Momento più opportuno per aerare: 2 gg dopo l’inizio della FA (fase di crescita) solo nelle fasi iniziali della FA il lievito può beneficiare dell’O2 L’arieggiamento comporta quasi sempre un innalzamento rapido delle temperatura (Arieggiamento + aggiunta di azoto) più efficace di (solo arieggiamento) Non sempre

Fattori fisico-chimici: chiarificazione La chiarificazione contribuisce alla finezza aromatica dei vini bianchi La chiarificazione viene condotta a basse temperature e con solfitazione Il lievito nel mosto chiarificato produce maggiori quantità di alcoli superiori, acidi grassi ed esteri corrispondenti La chiarificazione elimina i sedimenti vegetali e buona parte dei lieviti autoctoni È ben nota la bassa fermentescibilità dei mosti chiarificati eliminazione dei lieviti impoverimento in steroli e acidi grassi a catena lunga (bucce) (Pressatura senza pigiatura) meglio di (pigiatura energica) Maggiore contato con le bucce Il torbido colloidale presenta lo stesso effetto delle “scorze di lievito” adsorbimento dei C8 e C10. Misura della torbidità: <60 NTU bassa fermentescibilità, > 200 NTU difetti olfattivi

Gli arresti di fermentazione: le cause Nei paesi caldi le difficoltà di portare a temine la fermentazione --> vini liquorosi I progressi della microbiologia enologica --> vini sempre più secchi Nuove varietà --> uve più ricche di zuccheri mosti difficili da fermentare fermentazioni lente che si protraggono per diversi mesi Quando, di sotto di 1.005, la massa volunica diminuisce di soli pochi millesimi/gg si parla di arresto di fermentazione Ripresa della fermentazione zucchero residuo 15 g/L e alcool prodotto < 12 % --> facile zucchero residuo 10 g/L --> molto difficile Le cause che possono determinare l’arresto di fermentazione sono molteplici Effetto sinergico delle singole possibili cause

La pricipale conseguenza dell’arresto della fermentazione Le principali cause concentrazione elevata di zucchero zuccheraggio tardivo temperature eccessive temperature basse sbalzi termici carenze nutrizionali inibitori prodotti dal metabolismo secondario (C6, C8, C10) residui di pesticidi inibitori di orgine fungina modalità di estrazione del mosto (vinificazione in bianco) pH elevato inoculo iniziale quantitativamente insufficiente antagonismo lievito-lievito antagonismo lievito-batteri solfitazioni inadeguate chiarificazioni troppo spinte La diffusione della pratica dei rimontaggi con arieggiamento (anche nelle vinificazioni in bianco) ha permesso di limitare molto i casi di arresti di ferementazione La pricipale conseguenza dell’arresto della fermentazione Contaminazioni batteriche --> fermentazione malolattica, spunto lattico

Gli arresti di fermentazione: interventi L’AdF è facilmente messo in evidenza dalla mancata diminizione della densità in 24-48 ore Interventi volti a far ripartire la fermentazione evitare contaminazioni e sviluppo di batteri Vinificazione in rosso svinatura precoce (riduzione di batteri e lieviti) introdurre ossigeno abbassare la temperatura solfitazione inoculo di lieviti secchi attivi (inattivi già a 9% alcol) Preparazione dell’inoculo Mosto in AdF --> portare a 9% alcol e 15 g/L di zucchero solfitazione --> 3 g/hl inoculo --> 20 g/L (S. cerevisiae o S. bayanus, alcol resistenti) Monitorare la densità Quando tutti gli zuccheri sono stati consumati --> massimo delle crescita Usare al 5-10 %

Ripresa della fermentazione arrestata --> rischio di aumento dell’acidità volatile 50 mg/hl di acido pantotenico Temperatura alta --> favorisce la crescita --> maggiore effetto antimicrobico dell’etanolo --> maggiore produzione di acido acetico meglio 20-25 °C Inoculi con pigiato fresco di cantina --> 5-20 % --> lieviti freschi ed attivi --> aumenta anche lo zucchero Inoculi con fecce di fermentazione completata --> lieviti in fase di declino Coadiuvanti suscettibili di migliorare la ripresa della fermentazione Sali di ammonio (5 g/hl) Flash-pastorizzazione (72-76 °C per 20 secondi) Impiego di carbone attivo (10-20 g/hl, vini bianchi) Impiego di scorze di lievito (20-30 g/hl)

Riavvio per 10 hl di mosto   (1) Reidratare il lievito: 300 g (30 g/hl mosto arrestato) (2) Preparare un miscela acqua/mosto arrestato 25 litri mosto arrestato 25 litri acqua 25 grammi di nutriente complesso* portare il contenuto di zucchero a 50 g/L (3) Riavviare la fermentazione unire (1) con (2) Monitorare il contenuto degli zuccheri A 25 g/L di zuccheri aggiungere 2 hl di mosto arrestato trattato con 50 g di scorze di lievito Monitorare il consumo degli zuccheri Quando la metà degli zuccheri è stato consumato aggiungere altri 2 hl di mosto arrestato *Fosfato d’ammonio 5 g/hl Tiamina 50 mg/hl Pantotenato 50 mg/hl Biotina 1 mg/hl Peptone 200 mg/hl Tryptone 200 mg/hl Estratto di lievito 200 mg/hl