REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI Polymerase Chain Reaction (PCR) Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI Polymerase Chain Reaction (PCR) Enzima DNA Polimerasi da Thermus aquaticus (Taq), attività 5’3’. Non ha attività esonucleasica 3’ 5’. Caratteristiche: termoresistenza, specificità, fedeltà (1 nt sbagliato ogni 2x104) Componenti della PCR: DNA stampo; tampone specifico di reazione contente sali; primers (oligonucleotidi) specifici; deossinucleotidi trifosfati (dATP, dCTP, dGTP e dTTP); Taq polimerasi La reazione avviene in un termociclatore con un blocco di alluminio che può essere riscaldato e raffreddato rapidamente
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) +
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + denat. T = 94°C
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + denat. T = 94°C anneal.
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + denat. T = 94°C anneal. exten. T = 72°C nuovo DNA
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo denat. T = 94°C anneal. denat. exten. T = 72°C nuovo DNA
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo denat. T = 94°C anneal. denat. exten. T = 72°C nuovo DNA
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo denat. T = 94°C anneal. denat. exten. T = 72°C nuovo DNA
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo denat. T = 94°C anneal. denat. exten. T = 72°C nuovo DNA
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo III ciclo denat. T = 94°C denaturazione anneal. denaturazione exten. T = 72°C nuovo DNA
U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” U Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR) + II ciclo III ciclo denat. T = 94°C denaturazione anneal. denaturazione exten. T = 72°C nuovo DNA 23 = 8 8 molecole di DNA in 3 cicli
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) Ad ogni ciclo di PCR il numero di molecole di DNA bersaglio (tratto di DNA incluso tra i due primer) raddoppia. In una PCR di 40 cicli per ogni molecola di DNA inizialmente presente se ne formeranno 240, cioè un numero dell’ordine di 1012.
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
1° ciclo di PCR DNA genomico DNA genomico 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ Primer reverse Primer forward 5’ 3’ 3’ 5’ DNA genomico
2° ciclo di PCR 3’ 5’ 5’ 3’ 3° ciclo di PCR
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) 5’ 3’ ATTCGACCT ------------ GCTACTGG 3’ 5’ CGATGACC 5’ 3’ ATTCGACCT 3’ 5’ TAAGCTGGA----------- CGATGACC
Specificità dell’amplificazione: REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) Specificità dell’amplificazione: 1) Primers esatti ed a singola copia. Possibilità di usare dopo anche primers più interni (nested primers); 2) Scelta della temperatura di appaiamento dei primers. In genere tra 4 - 5°C inferiore a quella di dissociazione (melting). Calcolo della temperatura di dissociazione (4°C ogni G o C, 2°C ogni A o T); 3) Concentrazione di MgCl2 nel tampone (influenza sull’appaiamento e sull’attività enzimatica): alta concentrazione di sale = bassa stringenza = minore specificità. 4) Possibilità di utilizzare in reazione DMSO, formamide o glicerolo che diminuiscono la temperatura di denaturazione e di annealing:
Specificità della temperatura di annealing dei primers
Scelta della temperatura di annealing dei primers
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) Log [DNA] N° cicli Esponenziale Lineare Plateau Prodotto variabile Resa teorica: 2n P =(2)n T Il prodotto di PCR (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n). P dipende da T, numero di copie di stampo di DNA di partenza
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) Resa effettiva: effetto plateau Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato da: Quantità dei primers Attività della Taq polimerasi Reannealing dei filamenti Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti
Analisi dei prodotti della PCR DNA campione 3 con inserzione interna
APPLICAZIONI DELLA PCR Amplificazione a partire da 1 cellula umana = 6 pg DNA - Identificazione cellule tumorali, infezioni batteriche e virali; - diagnosi prenatale; - analisi del DNA antico; - analisi popolazionistiche (radice capello, cartellino con sangue, cellule mucosa buccale); - analisi medico-legali da tracce Amplificazione prima del clonaggio; studio di RFLP e VNTR, individuazione delle mutazioni con PCR allele specifica, RT-PCR (PCR dopo trascrizione inversa), DOP-PCR (PCR con primers degenerati).
PCR allele specifica
Microsatelliti analizzati con PCR e gel di acrilammide