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Lezioni di biotecnologie 2 2 2

Analisi del DNA e delle proteine Lezione 2 Analisi del DNA e delle proteine 3 © Zanichelli editore, 2014 3

Analizzare DNA e proteine Per le applicazioni delle biotecnologie è di fondamentale importanza: essere in grado di identificare con precisione le sequenze di DNA di interesse; analizzare il contenuto della loro informazione per stabilirne la funzione; identificare i prodotti proteici corrispondenti; saper localizzare geni e proteine all’interno delle cellule. Esistono tecniche in grado di rispondere a tutte queste esigenze. 4 © Zanichelli editore, 2014 4

Leggere il DNA Un aspetto fondamentale delle biotecnologie è la possibilità di poter leggere la sequenza del DNA, in modo da identificare con certezza la presenza dei geni o delle regioni regolative che ci interessa clonare. La lettura della sequenza del DNA ha costituito una tappa fondamentale nella nascita delle biotecnologie. Il procedimento attraverso cui si identificano le singole basi che compongono una molecola di DNA è detto sequenziamento. 5 © Zanichelli editore, 2014 5

Il moderno sequenziamento (I) Per il sequenziamento sono necessari: il filamento di DNA stampo (di cui vogliamo leggere la sequenza); un innesco complementare a una regione dello stampo (per l’inizio della reazione di DNA polimerasi); la DNA polimerasi; una miscela di 4 nucleotidi (dNTPs); i 4 dideossinucleotidi (ddNTPs) fluorescenti. 6 © Zanichelli editore, 2014 6

Il moderno sequenziamento (II) La DNA polimerasi viene incubata in presenza del DNA, dei 4 dNTPs e di uno specifico ddNTP, posto a un rapporto molare con il corrispondente dNTP (per esempio ddATP verso dATP), tale per cui venga incorporato solo a una determinata frequenza. Se la concentrazione di ddATP fosse troppo alta, infatti, tutte le molecole di DNA si arresterebbero alla prima T. In questo modo, invece, solo una frazione del DNA sintetizzato sarà bloccato ogni volta che sullo stampo è presente una T. 7 © Zanichelli editore, 2014 7

Il moderno sequenziamento (IV) Facendo quattro reazioni separate, una per ogni ddNTP, sarà possibile identificare ogni base presente sullo stampo, basandosi sull’incorporazione del ddNTP complementare. 8 © Zanichelli editore, 2014 8

Sequenziamento del DNA per PCR (I) Nella metodica classica di Sanger era necessaria una quantità rilevante di DNA per poter rilevare i frammenti sintetizzati. Oggi è possibile sequenziare quantità minime di DNA grazie all’uso della PCR, in cui il campione di partenza viene prima amplificato e successivamente vengono aggiunti i ddNTPs fluorescenti. I moderni sequenziatori automatici utilizzano l’accoppiamento tra PCR e metodo Sanger. I frammenti vengono separati in microtubi di poliacrilammide e contemporaneamente letti dal raggio laser. 9 © Zanichelli editore, 2014 9

Sequenziamento del DNA per PCR (II) Un sequenziatore automatico Immagine: Konrad Förstner via Wikimedia Commons Traccia della sequenza generata dal sequenziatore 10 © Zanichelli editore, 2014 10

Analisi delle sequenze Nel 2003 è stato completato il sequenziamento del genoma umano. Ma anche il genoma di molti altri organismi è stato completamente sequenziato. La sequenza del DNA genomico è costituita da una serie ininterrotta di milioni o miliardi di lettere (ciascuna corrispondente ad una base A,T,C,G) e quindi la sua lettura dall’occhio umano non consente di estrarre alcuna informazione utile. Per poter decodificare l’informazione contenuta nella sequenza del DNA sono necessari strumenti bioinformatici. 11 © Zanichelli editore, 2014 11

Analisi delle sequenze: fase di lettura Il livello di analisi più semplice è l’individuazione di geni, ovvero di sequenze codificanti. Dato che ogni amminoacido è codificato da una tripletta (3 nucleotidi), ciascuna sequenza di DNA può essere letta in tre modi diversi (a partire cioè dalla prima, seconda o terza base) o fasi di lettura. I programmi informatici effettuano la lettura a triplette su ciascuna delle tre possibili fasi di lettura e identificano quella in grado di codificare per un prodotto proteico (generalmente le fasi sbagliate mostrano codoni di stop dopo pochi amminoacidi e quindi non sono geni). 12 © Zanichelli editore, 2014 12

Analisi delle sequenze: omologie (I) Tutte le sequenze accumulate negli anni sono conservate in banche dati liberamente accessibili. Una nuova sequenza può così essere confrontata con quelle note. I programmi sono in grado di evidenziare le sequenze comuni e il grado di somiglianza. Sequenze identiche avranno la medesima funzione. Sequenze che si assomigliano identificheranno probabilmente funzioni simili in organismi evolutivamente distanti. Grazie all’analisi comparativa delle sequenze è possibile identificare geni simili in organismi diversi, costruire alberi genealogici e stabilire relazioni evolutive tra i geni. 13 © Zanichelli editore, 2014 13

Analisi delle sequenze: omologie (II) Mappa circolare che compara il genoma del cromosoma 1 umano con l’intero genoma del topo: le linee colorate collegano i geni ortologhi, ovvero geni simili per struttura tra le due specie. 14 © Zanichelli editore, 2014 14

Localizzazione del DNA nella cellula Oggi è possibile evidenziare la posizione di una qualsiasi sequenza di DNA sul genoma cellulare in vivo. Viene utilizzata la tecnica FISH (fluorescence in situ hybridization) o ibridazione fluorescente in situ, che sfrutta la capacità delle sequenze complementari di DNA di appaiarsi. 15 © Zanichelli editore, 2014 15

FISH: applicazioni Grazie alla FISH è stato possibile mappare la disposizione spaziale dei cromosomi umani nel nucleo interfasico delle cellule. Immagine: Bolzer et al. (2005), PloS Biology, via Wikimedia Commons 16 © Zanichelli editore, 2014 16

Western Blotting È possibile identificare la presenza di una specifica proteina all’interno di una miscela complessa utilizzando la tecnica detta Western Blotting. La tecnica si divide in 3 fasi: Separazione delle proteine su gel di poliacrilammide Trasferimento delle proteine su membrana Rilevazione con anticorpi specifici per la proteina di interesse. 17 © Zanichelli editore, 2014 17

Western Blotting: il gel La miscela di proteine viene caricata su di un gel di policrilammide. Questo è un polimero dell’acrilammide, la cui struttura tridimensionale è formata da fibre. Il suo potere risolutivo è superiore a quello dell’agarosio, in virtù della maggiore densità delle maglie. L’acrilammide liquida viene miscelata con opportuni reagenti che ne causano la polimerizzazione a temperatura ambiente. 18 © Zanichelli editore, 2014 18

Western Blotting: separazione (I) La poliacrilammide viene fatta polimerizzare in verticale tra due vetri in presenza di una mascherina (detta «pettine») che forma in cima al gel delle tasche (i pozzetti) in cui sarà depositato il campione. Lo spessore del gel è di circa 1,5 mm. Al gel viene applicato un campo elettrico e le proteine vengono separate sulla base del loro peso molecolare, in modo analogo ai frammenti di DNA sul gel di agarosio. Immagine: Mark Sommerfeld via Wikimedia Commons 19 © Zanichelli editore, 2014 19

Western Blotting: separazione (II) La separazione avviene facendo migrare le proteine dal polo negativo a quello positivo, ma le proteine non hanno una carica uniforme negativa e spesso hanno forme diverse (globulari, filamentose) che potrebbero influenzare la corsa. 20 © Zanichelli editore, 2014 20 20

Western Blotting: separazione (III) Le proteine separate sul gel possono essere visualizzate con diversi coloranti (per esempio il blu di Coomassie). Elettroforesi su gel di poliacrilammide con proteine colorate dal blu di Coomassie 21 © Zanichelli editore, 2014 21

Western Blotting: trasferimento (I) Il gel contenente le proteine (non colorato) viene messo in contatto con una membrana di nitrocellulosa, una sostanza carica positivamente che tratterrà le proteine cariche negativamente. Il gel e la membrana sono messi tra due fogli di carta assorbente e inseriti in un apparecchio che applica un campo elettrico, facendo migrare le proteine dal gel alla membrana. 22 © Zanichelli editore, 2014 22

Western Blot: trasferimento (II) Immagine: Bensaccount via Wikimedia Commons 23 © Zanichelli editore, 2014 23 23

Western Blotting: trasferimento (II) Le proteine fissate sulla membrana possono essere evidenziate con diverse colorazioni reversibili (per esempio rosso Ponceau) per controllare l’avvenuto trasferimento. Immagine: Argymeg via Wikimedia Commons 24 © Zanichelli editore, 2014 24

Western Blotting: rivelazione Grazie a questa tecnica è possibile identificare la presenza di una singola proteina tra migliaia di proteine diverse. 25 © Zanichelli editore, 2014 25

Identificazione di proteine in cellula (I) Utilizzando una tecnica analoga alla FISH, è possibile visualizzare una proteina all’interno della cellula. La tecnica di immunofluorescenza si basa sull’utilizzo di un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse e di un anticorpo secondario in grado di legare quello primario e coniugato ad un gruppo fluorescente. 26 © Zanichelli editore, 2014 26

Identificazione di proteine in cellula (II) Le cellule vengono fissate su di un vetrino e incubate con l’anticorpo primario. Successivamente sono poste in contatto con l’anticorpo secondario. Infine vengono osservate al microscopio con illuminazione laser. Il segnale fluorescente mostra la posizione della proteina nella cellula. È possibile usare anticorpi con fluorescenze di colore diverso per evidenziare più proteine contemporaneamente. 27 © Zanichelli editore, 2014 27