Costruzione di librerie di cDNA
Costruzione di librerie di cDNA - Lisi cellulare - Estrazione dell’RNA - Colonna cromatografica cellulosa con oligodT
Costruzione di librerie di cDNA Aggiunta di frammenti polylinker con siti per enzimi di restrizione per clonaggio in vettori plasmidici o di espressione
Costruzione di librerie di cDNA
Costruzione di librerie di cDNA Rnasi H: frammenti di RNA non degradati come primer Oppure utilizzo di esameri random come primer DNA pol I - ligasi Polylinker con sito di clonaggio Digestione enzimatica - Inserzione nel vettore + ligasi Es: libreria di cDNA del grano
GENOMICA: studio del genoma nella sua interezza Come si ottiene la sequenza genomica completa di un organismo? La sequenza genomica è il punto di partenza di nuove analisi per lo studio della struttura, della funzione e dell’evoluzione sia dell’intero genoma che di sue porzioni I metodi di studio del genoma utilizzano: la bioinformatica la genomica comparativa la genomica funzionale
COME SI OTTIENE LA SEQUENZA DI UN INTERO GENOMA? Due strategie: assemblaggio di cloni genomici in contigui attraverso vari metodi, ricostruzione di una mappa lineare, sequenziamento dei cloni. sequenziamento casuale di un enorme numero di cloni e loro assemblaggio in base alla sovrapposizione delle sequenze (WGS = Whole Genome Shotgun Sequencing).
Sequenziamento di cloni ordinati in contigui
WGS = Whole Genome Shotgun Sequencing Stringhe di 600 bp 10 letture indipendenti sequenza consensus di ogni specie
Metodo WGS e clonaggio in vettore con estremità note (Primer 1 e 2)
WGS – primer walking PCR o sequenziamento di frammenti non clonati PCR spazio breve
WGS = Whole Genome Shotgun Sequencing