Introduzione plasmidi circolari di lievito plasmide 2m: ripartizione e regolazione del numero di copie plasmide pKD1: ripartizione e ricombinazione plasmide pKD1: inattivazione ricombinasi plasmide pKD1: sovraespressione ricombinasi?
Costruzione del vettore Integrativo pLAU16 Costruzione del ceppo Integrativo BT16 trasformazione integrazione Ceppo BT16 Ceppo MW98-8C
ANALISI DEL CEPPO INTEGRATIVO BT16 Ceppo BT16 Stabilità del fenotipo Ura+: 100% Crescita su glucosio o galattosio rispetto al ceppo parentale MW98-8C Analisi del DNA integrato (Southern DNA cromosomale) INDUZIONE DEL GENE A SU GALATTOSIO 10 VOLTE
VETTORI DI ESPRESSIONE PER LE PROTEINE ETEROLOGHE INTERLEUKINA 1- E GLUCOAMILASI
ANALISI DEI TRASFORMANTI: Stabilità e Numero di copie vettore ceppo fonte C Ura+ G418 Ratio* IL BT16 Gal 99 95 6.6 Glu 100 A-IL 78 11 89 GAM 97 6.7 wt 1.4 98 1.5 96 * = rapporto numero di copie galattosio/glucosio
AUMENTO NUMERO DI COPIE SU GALATTOSIO: Analisi Southern dei trasformanti pGM-IL pGM-GAM R = rilassato S = superavvolto
VERIFICA AMPLIFICAZIONE SU pKD1 BT16 (gene A, cir0) PM6-7A (cir+) incrocio diploide meiosi Segregante GMB1 (gene A, cir+) Gal/Glu 3 - 4 volte aumento copie pKD1
MISURA della GLUCOAMILASI Sopranatante + Tampone Amido t0 prelievo + I2 A580 t1 t2 t3 t4
PRODUZIONE DI GLUCOAMILASI tempo fonte C GAM# Ratio* G418 Ura+ 24 Gal 6.7 100 92 Glu 99 98 48 59 4.5 90 38 72 113 6.5 82 31 14 # = Attività glucoamilasica (mU/ml) * = Rapporto numero di copie
PRODUZIONE DI INTERLEUKINA da promotore inducibile PHO5 1° FASE: crescita su galattosio + alto fosfato Induzione gene A Biomassa e aumento Numero di copie 2° FASE: crescita su glucosio + basso fosfato Induzione gene IL-1 PRODUZIONE
INTERLEUKINA SECRETA
INTERLEUKINA TOTALE IMMUNOREATTIVA (test ELISA) clone fonte C IL-1 totale secreta g/ml pg/cell (%) 1 Gal 101 1.7 87 Glu 40 0.15 90 2 69 1.0 75 0.12 76 3 97 0.9 80 45 78
DISCUSSIONE dei RISULTATI Produzione di Proteine Eterologhe da vettori repicativi: importanza della stabilita' a lungo termine e del numero di copie Il controllo del numero di copie di pKD1 corrisponde al modello di 2m Numero di copie sotto induzione del gene A: problema della saturazione Aumento numero di copie aumento del prodotto (GAM e IL-1) Confronto S. cerevisiae vs K. lactis: 1-2 mg/L vs 100-400 mg/L (IL-1) Problemi tecnici: biomassa da galattosio insufficiente espressione simultanea di gene A e gene eterologo Morlino GB et al. Inducible amplification of gene copy number and heterologous protein production in the yeast Kluyveromyces lactis (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65:4808-4813