Lezione 8 Inibizione enzimatica Controllo dell’attività enzimatica degli enzimi regolatori 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Capitolo 6 Gli enzimi continua

Gli inibitori enzimatici Sono molecole che interferiscono con la catalisi di una reazione riducono la velocità di reazione l’equilibrio di reazione si raggiungerà in un tempo maggiore bloccano la reazione l’equilibrio di reazione non si raggiungerà 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA Due tipi di inibizione INIBIZIONE REVERSIBILE L’inibitore forma un complesso reversibile (E:::I) con l’inibitore, grazie a legami deboli INIBIZIONE IRREVERSIBILE L’inibitore forma un complesso irreversibile (E-I) con l’inibitore, grazie a legami forti (covalenti o elettrostatici) 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Inibizione reversibile Sono noti TRE tipi di inibizione reversibile COMPETITIVA INCOMPETITIVA (≠ NON COMPETITIVA) MISTA (competitiva + incompetitiva) 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Inibizione competitiva L’inibitore si lega al sito attivo dell’enzima Substrato e inibitori competono per il legame nel sito attivo dell’enzima Coesistono ES e EI 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

La cinetica enzimatica in presenza di un inibitore competitivo Maggiore è [I], maggiore è la Km apparente La reazione tende alla stessa Vmax source http://oregonstate.edu/instruct/bb450/fall14/stryer7/8/figure_08_16.jpg 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Il modello dell’inibizione competitiva source http://oregonstate.edu/instruct/bb450/fall14/stryer7/8/figure_08_16.jpg Il complesso EI non ha attività catalitica Il substrato può spiazzare l’inibitore dal complesso EI 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

L’equazione cinetica dell’inibizione competitiva αKm è la Km apparente KI è la costante di dissociazione del complesso EI 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

L’inibitore competitivo non influenza la Vmax della reazione source http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/IntroductionToPracticalBiochemistry/ch09s04.html Più aumenta [S], meno efficace è I 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Inibizione incompetitiva L’inibitore si lega vicino al sito attivo dell’enzima Substrato e inibitori NON competono per il legame nel sito attivo dell’enzima Coesistono ES e ESI ESI/ES indica la potenza dell’inibitore 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

La cinetica enzimatica in presenza di un inibitore incompetitivo Maggiore è [I], minore è la Vmax di reazione SP Maggiore è [I], maggiore è la Km apparente source http://oregonstate.edu/instruct/bb450/fall14/stryer7/8/figure_08_18.jpg 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Il modello dell’inibizione incompetitiva source file:///Users/sabina/Documents/BIOCHIMICA/2018-2019/Medicina/Lezioni/Flashman_Enzymology_2nd_Year_L3.pdf L’inibitore si lega solo a ES Il complesso ESI non è catalitico 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

L’equazione cinetica dell’inibizione incompetitiva KI è la costante di dissociazione del complesso ESI 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA source http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/IntroductionToPracticalBiochemistry/ch09s04.html 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

L’inibitore incompetitivo influenza sia la Vmax che la Km La Vmax è ridotta perché il complesso ESI non è catalitico La Km è aumentata perché solo una frazione di E può fare il complesso ES; per aumentare la [ES] serve una maggior [S] (succede così per le reazioni bimolecolari) 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Terzo tipo di inibizione Inibizione mista Inibizione non competitiva considerato caso speciale dell’inibizione mista 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Il modello dell’inibizione non competitiva oppure misto Il substrato e l’inibitore possono legarsi simultaneamente a E L’inibitore può legarsi sia a E che a ES L’inibitore non influenza l’affinità di E per S Il complesso ESI non ha attività catalitica Quando [S] = ∞, [Etot] = [ES] + [ESI]; [ES] = [Etot] – [ESI] e kcat diminuisce source http://oregonstate.edu/instruct/bb450/fall14/stryer7/8/figure_08_16.jpg 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA La cinetica enzimatica in presenza di un inibitore misto o non competitivo Maggiore è [I], minore è la Vmax di reazione SP La Km apparente: non cambia se I è non competitivo si abbassa se I è misto NOTA TECNICA: ben difficile ottenere misure precise. Per questo motivo testi diversi presentano il tema in modo diverso source http://oregonstate.edu/instruct/bb450/fall14/stryer7/8/figure_08_18.jpg 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

L’equazione cinetica dell’inibizione mista In certi casi sperimentali, α e α’ hanno lo stesso valore e l’inibizione è non competitiva 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Inibizione non competitiva L’inibitore si lega lontano dal sito attivo dell’enzima Substrato e inibitori NON competono per il legame nel sito attivo dell’enzima 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA Se l’inibitore è misto, influenza la Km e la Vmax della reazione con coefficienti α e α’ diversi Source http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/IntroductionToPracticalBiochemistry/ch09s04.html 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA Se l’inibitore è non competitivo, influenza la Km e la Vmax della reazione con coefficienti α e α’ uguali e l’intercetta sull’asse x è la stessa Se α=α’, α’/α è uguale a 1 vedi diapositiva seguente Source http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/IntroductionToPracticalBiochemistry/ch09s04.html 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Se l’inibitore è non competitivo non influenza la Km della reazione pendenza Km / α’Vmax pendenza Km / Vmax I è efficace (riduce Vo) a tutte le [S] 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA Riassunto 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Inibitori irreversibili Si legano in modo stabile all’enzima con legami covalenti con interazioni particolarmente stabili (elettrostatiche) Si legano in zone dell’enzima più o meno distanti dal sito attivo nel sito attivo inibitori suicidi inibitori basati sul meccanismo di reazione analoghi dello stato di transizione 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

In breve tempo, l’enzima non funziona più source http://flashman.chem.ox.ac.uk/docs/Flashman_Enzymology_2nd_Year_L3.pdf 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

L’aspirina è un inibitore irreversibile della ciclossigenasi 1 source http://tmedweb.tulane.edu/pharmwiki/doku.php/non-selective_cox_1_2_inhibitors 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA source https://slideplayer.com/slide/6551587/ 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA Enzimi regolatori Fanno parte delle vie metaboliche, e ne catalizzano una delle prime tappe reazioni chimiche sequenziali, dove il prodotto di un enzima è substrato della reazione successiva ABCDEF La loro attività catalitica è regolata: sono regolati A loro volta, essi regolano la produzione del prodotto finale della via metabolica Se diminuisce la formazione di B, anche la formazione di C e D diminuirà 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Il controllo dell’attività enzimatica Tre meccanismi Transizione allosterica interessa la struttura quaternaria Modificazione chimica post-traduzionale reversibile interessa la struttura primaria, ma ha impatto su tutti gli altri livelli di struttura Proteolisi post-traduzionale irreversibile interessa la struttura primaria di precursori (detti zimogeni), ma ha impatto su tutti gli altri livelli di struttura 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Il controllo dell’attività enzimatica Transizione allosterica piccole molecole agiscono da effettori allosterici positivi (attivatori) o negativi (inibitori) proteine possono legarsi all’enzima e influenzarne la cinetica La modificazione chimica post-traduzionale reversibile i gruppi R delle proteine sono modificati con addotti covalenti. L’addotto può essere rimosso in modo controllato e l’enzima ritorna allo stato originario (struttura e funzione) Per attivazione proteolitica un propeptide enzimatico (detto zimogeno, inattivo) è idrolizzato da una proteasi specifica e il prodotto maggiore di idrolisi è attivo 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Modello di attivazione e inattivazione di un enzima allosterico source http://driver-poll.weebly.com/blog/allosteric-activator 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

La cinetica degli enzimi allosterici The binding between an allosteric enzyme and a substrate follows a sigmoid curve, which moves from side to side depending on the effector concentration, thereby regulating enzymatic activity. source http://csls-text.c.u-tokyo.ac.jp/active/07_07.html 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Gli enzimi allosterici non seguono la Legge di Michaelis Menten La dipendenza di Vo da [S] è descritta da una curva sigmoide La cinetica è di saturazione, perché a [S] molto alta Vo ≅ Vmax K0.5 = [S] alla quale Vo=Vmax/2 Non si può caratterizzare un enzima allosterico mediante la Km, perché la cinetica non è descritta dall’equazione di Michaelis Menten K0.5 varia con [effettore] 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

A cooperative structural change model for allosteric enzymes Such enzymes are generally polymers, and the strength of activity is varied (as if turning a switch on and off) through cooperative structural changes in all subunits. source http://csls-text.c.u-tokyo.ac.jp/active/07_07.html varied ≠ changed variazioni graduali ≠ cambiamenti interi 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

La modificazione covalente degli enzimi Fosforilazione della serina o della treonina Adenililazione Acetilazione Metilazione Miristilazione Ubiquitinazione 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Fosforilazione reversibile delle proteine source https://chemistry.tutorvista.com/biochemistry/phosphorylation.html Il fruppo fostato è trasferito dall’ATP alla proteina (E) L’estere fosfoproteina (E-P) può essere può essere idrolizzato La reazione netta è l’idrolisi dell’ATP 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA La fosforilazione e la defosforilazione delle proteine/enzimi sono processi catalizzati source https://chemistry.tutorvista.com/biochemistry/phosphorylation.html La fosforilazione di una proteina determina una variazione strutturale (spesso conformazionale) e funzionale 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Fosforilazione/Defosforilazione degli enzimi FOSFORILAZIONE: Catalizzata dalle proteina chinasi Classe delle transferasi (E.C. 2) Sottoclasse delle fosfotransferasi (E.C. 2.7) Il gruppo accettore è il gruppo alcolico della serina o treonina delle proteine (E.C. 2.7.11) DEFOSFORILAZIONE: L’estere fosforico del gruppo ossidrilico della serina o della treonina può essere idrolizzato dalle proteine fostafatasi Classe delle idrolasi (E.C. 3) Sottoclasse di enzimi che agiscono sugli esteri (E.C. 3.1) L’estere è un monoestere (E.C. 3.1.3) 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Metilazione delle proteine source https://www.nature.com/articles/nrm3915 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

La metilazione è reversibile source https://www.nature.com/articles/nrm3915 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

Attivazione di zimogeni per proteolisi I precursori Proteasi digestive Fattori della coagulazione (vedi libro) Insulina e altri ormoni (a tempo debito) source https://slideplayer.com/slide/6291572/ 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

L’attivazione per a proteolisi controllata Se il precursore origina un enzima, esso si chiama pro-enzima o zimogeno Se il precursore origina proteine con altre funzioni (di legame, come gli ormoni), esso si chiama pro-peptide o pre-propeptide in certi casi si libera una serie di peptidi di massa molecolare progressivamente minore La proteolisi determina l’esposizione del sito attivo dell’enzima o della conformazione attiva dell’ormone 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA source https://slideplayer.com/slide/6291572/ 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA

785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA Fine A domani ore 15:00 Nucleotidi e acidi nucleici Lipidi Oppure 14/03/2019 - S.Passamonti 785ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA