PURIFICAZIONE DELLA PROTEINA GFP

La proteina GFP presenta una struttura terziaria definita β-barrel, dei nastri a foglietto-β e delle estremità α-elica. All’interno della struttura è presente il centro cromoforo, responsabile del colore e della fluorescenza. La GFP assorbe la radiazione ultravioletta e la riemette ad una lunghezza d’onda maggiore ad energia minore.

Prendere la colonia di batteri trasformati dalla piastra e rimetterli a crescere nel terreno di coltura liquido, in modo da ottenere una maggiore quantità di proteina GFP.

Fasi della purificazione della GFP: Lisi delle cellule batteriche, attraverso lo shock osmotico. Centrifugazione del lisato contenuto all’interno della provetta al fine di separare le frazioni più pesanti insolubili da quelle più leggere e solubili. Cromatografia ad interazione idrofobica.

CROMATOGRAFIA Tecnica che consente la separazione dei singoli componenti di una miscela in base alle loro caratteristiche chimico-fisiche. La cromatografia a interazione idrofobica sfrutta in particolare la diversa apolarità delle molecole per selezionare quelle più affini alla sua matrice idrofobica.

Prelevare 250 µl di contenuto della provetta contenente batteri, facendo attenzione a prelevare solamente il surnatante. Inserire ciò che si è prelevato nella provetta Ti, contenente 250 µl di Solfato di Ammonio 4 molare (NH4)2SO4.

Attaccare la siringa al filtro, costituito da una resina contenente sfere idrofobiche che non interagiscono con le proteine ma riescono comunque a farle legare alla struttura.

Stantuffare fino in fondo Stantuffare fino in fondo. La GFP rimane così attaccata alla resina, grazie ai gruppi idrofobici. La resina è a 2 molare, così aggiungendo 250 µl di solfato di ammonio 1,3 molari. Le impurità si staccano dalla resina, consentendo solo alla GFP di rimanere legata alla resina stessa. Quindi aggiungere 1ml di acqua. In questo modo il DNA e il plasmide, che si trovavano nel surnatante, essendo idrofili, raggiungono gli scarti sul fondo della provetta che si presentano come una sorta di schiuma che prende il nome di albumina.

Aggiunta di solfato di ammonio e acqua distillata

Utilizzare la siringa per prelevare la parte contenente la proteina diluita. Prendere le 5 cuvette e distribuire il contenuto della siringa all’interno di ognuna di esse, inserendo 3 gocce per ogni cuvetta. Utilizzare la lampada a raggi ultravioletti per osservare i risultati. La GFP esce all’interno delle cuvette solamente con le prime gocce, così sarà possibile osservare la fluorescenza nelle prime due cuvette.

In soluzione acquosa attorno agli atomi della GFP si crea una sfera di idratazione con le molecole di acqua che si orientano secondo la loro polarità e prendono legami idrogeno con gli amminoacidi della proteina. Intorno alle porzioni apolari le molecole d’acqua formano un Cluster, una struttura organizzata con legami a idrogeno che si instaurano tra le molecole d’acqua. Gli amminoacidi apolari risultano rivolti all’interno della proteina. Per estrarre la GFP è necessario quindi introdurre una soluzione salina altamente concentrata, in quanto il sale disidrata la proteina. Le molecole d’acqua vengono attratte dal sale e così espongono gli amminoacidi idrofobici.

Struttura della proteina in soluzione acquosa