LE MACROMOLECOLE sono polimeri formati dall’unione di molecole più piccole dette monomeri. Possono essere omopolimeri o eteropolimeri. Polisaccaridi Proteine Acidi nucleici

a Struttura degli amminoacidi: carbonio a gruppo amminico gruppo carbossilico un atomo di idrogeno un gruppo R che differenzia i vari amminoacidi carbonio a a STRUTTURA DIMENSIONI CARICA SOLUBILITA’ dell’a.a. in H2O

atomo di carbonio a = centro chirale forme D e L immagini speculari non sovrapponibili: enantiomeri molecole otticamente attive (ruotano il piano della luce polarizzata) le proteine sono costituite solo da isomeri L

Formule geometriche

Proiezioni di Fischer

Amminoacidi Abbreviazioni Gruppi R non polari, alifatici Glicina Gly G Alanina Ala A Prolina Pro P Valina Val V Leucina Leu L Isoleucina Ile I Metionina Met M Gruppi R aromatici Fenilalanina Phe F Tirosina Tyr Y Triptofano Trp W Gruppi R polari, non carichi Serina Ser S Treonina Thr T Cisteina Cys C Asparagina Asn N Glutammina Gln Q Gruppi R polari, carichi positivamente Lisina Lys K Istidina His H Arginina Arg R Gruppi R polari, carichi negativamente Aspartato Asp D Glutammato Glu E

Gruppi R alifatici non polari H 3 N O C H 3 N O C H 3 N O Glicina Alanina Valina (Gly ; G) (Ala ; A) (Val ; V) C H 3 N O 2 C H 3 N O 2 C H 3 N O 2 S C H 3 N O 2 Leucina Isoleucina Prolina (Leu ; L) (Ile ; I) (Pro ; P) Metionina (Met ; M)

Gruppi R aromatici Fenilalanina Tirosina Triptofano (Phe ; F) 3 N O 2 C H 3 N O 2 C H 3 N O 2 Fenilalanina Tirosina Triptofano (Phe ; F) (Tyr ; Y) (Trp ; W)

Gruppi R polari non carichi 3 N O C H 3 N O 2 C H 3 N O 2 S Serina Treonina Cisteina (Ser , S) (Thr ; T) (Cys ; C) C H 3 N O 2 C H 3 N O 2 Asparagina Glutammina (Asn ; N) (Gln ; Q)

Catena A Catena B S GIVEQCCASVCSLYQLENYCN S S FVQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA

Gruppi R carichi positivamente 3 N O 2 C H 3 N O 2 C H 3 N O 2 Lisina Arginina Istidina (Lys ; K) (Arg ; R) (His ; H)

GRUPPI R carichi negativamente Aspartato (Asp; D) Glutammato (Glu, E)

Amminoacidi essenziali H 3 N O 2 Leucina (Leu ; L) C H 3 N O 2 Isoleucina (Ile ; I) C H 3 N O Treonina (Thr ; T) C H 3 N O Valina (Val ; V) C H 3 N O 2 Lisina (Lys ; K) C H 3 N O 2 Tirosina (Tyr ; Y) C H 3 N O 2 Istidina (His ; H) C H 3 N O 2 Triptofano (Trp ; W) C H 3 N O 2 S Metionina (Met ; M)

ANFOLITI H C +NH3 R COO NH2 + H+ H C +NH3 R COO + H+ COOH - R COO NH2 + H+ Zwitterione Forma anionica H C +NH3 - R COO Zwitterione + H+ COOH Forma cationica ANFOLITI a pH = 7 il gruppo amminico e il gruppo carbossilico sono entrambi nella forma dissociata

[H+] [A-] Ka= [HA] pKa= log 1 = -log Ka Ka COOH COO- + H+ Acidi poliprotici deboli COOH COO- + H+ NH3+ NH2 + H+ pH aumenta pH diminuisce HA H+ + A- [H+] [A-] [HA] Ka= pKa= log 1 = -log Ka Ka

pK1 + pK2 2,34 + 9,60 pI 5,97 = 2 GLICINA pK1 = 2,34 pK2 = 9,60 COOH H H3N + GLICINA C COO- H H3N + carica 0 pK1 = 2,34 C COO- H H2N carica -1 pK2 = 9,60 carica +1 pI = pK1 + pK2 2 2,34 + 9,60 5,97

pK1 + pKR 2,19 + 4,25 pI 3,22 = 2 ACIDO GLUTAMMICO carica +1 carica 0 COOH CH2 H H3N + pK1 = 2,19 carica 0 C COO- CH2 H H3N + COOH pKR = 4,25 carica -1 C COO- CH2 H H3N + pK2 = 9,67 carica -2 C COO- CH2 H H2N carica +1 pI = pK1 + pKR 2 2,19 + 4,25 3,22

pKR + pK2 6,0 + 9,17 pI 7,59 = 2 ISTIDINA carica +1 carica 0 carica -1 H N COOH CH2 H3N + NH CH pK1 = 1,82 carica +1 C COO- CH2 H H3N + NH CH N pKR = 6,0 carica 0 C COO- CH2 H H3N + NH CH N pK2 = 9,17 carica -1 C COO- CH2 H H2N NH CH N carica +2 pI = pKR + pK2 2 6,0 + 9,17 7,59

pI Il punto isoelettrico è dato dalla semisomma dei pK con cui lo zwitterione è in equilibrio

ELETTROFORESI L’elettroforesi è una metodica che consente la separazione di sostanze ionizzabili, sottoponendo la miscela all’azione di un campo elettrico. La forza che muove le molecole è il potenziale elettrico (E). La mobilità elettroforetica (m) della molecola è il rapporto tra le velocità della particella (v) e il potenziale elettrico. m = v/E

HCl 6M 105-110 °C Tempo di ritenzione

Legame ammidico

Estremità Ammino-terminale Carbossi-terminale Residuo N-terminale Residuo C-terminale

Numero di catene polipeptidiche Dati molecolari di alcune proteine Citocromo c Ribonucleasi A Chimotripsinogeno Emoglobina Albumina Peso molecolare Numero di residui Numero di catene polipeptidiche 13.000 13.700 22.000 64.500 68.500 104 124 245 574 609 1 4

Le proteine hanno funzioni biologiche diverse enzimi proteine di trasporto proteine contrattili proteine di difesa proteine strutturali

Proteine coniugate Classe Gruppi prostetici Lipoproteine Glicoproteine Fosfoproteine Emoproteine Flavoproteine Metalloproteine Classe Gruppi prostetici Lipidi Carboidrati Gruppi fosfato Eme Nucleotidi flavinici Ferro Calcio Molibdeno Rame

Struttura primaria Conformazione Funzione (sequenza) (struttura tridimensionale)

La determinazione della sequenza di una proteina può essere riassunta in otto punti 1. Se ci sono più di una catena polipeptidica è indispensabile separare le catene 2. Ridurre i ponti disolfuro 3. Determinare il residuo N-terminale 4. Determinare la composizione amminoacidica di ogni catena 5. Clivare le catene polipeptidiche in frammenti più piccoli 6. Ripetere il punto 5 usando diverse proteasi in maniera tale da avere un set diverso di peptidi 7. Determinare la sequenza di tutti i peptidi 8. Ricostruire la sequenza della proteina sovrapponendo le sequenze dei singoli peptidi

Step 1: Separazione delle catene Diverse subunità sono tenute insieme da forze deboli: La separazione può essere raggiunta: - con pH estremi - 8M urea - 6M guanidina HCl tuttavia, alcune catene sono tenute insieme da legami covalenti…. Ponti disolfuro Un legame covalente tra le catene laterali di due residui di cisteine

RS-SR  2 R-SO3- Step 2: Clivaggio di un ponte disolfuro O H C OOH Ossidazione con acido performico H C OOH O RS-SR  2 R-SO3-

R-CH2-SH + ICH2-CONH2  R-CH2-S-CH2-CONH2 + HI Reagenti dei gruppi sulfidrilici (rigenerano cisteine libere) - mercaptoetanolo HO-CH2CH2-SH - seguito da un agente alchilante come la iodoacetamide per impedire che i ponti disolfuro si possano riformare : R-CH2-SH + ICH2-CONH2  R-CH2-S-CH2-CONH2 + HI

Reagenti dei gruppi sulfidrilici mercaptoetanolo HO-CH2CH2-SH seguito da un agente alchilante Iodoacetamide ICH2-CONH2 Iodoacetato ICH2-COO-

Step 3: Determinazione residuo N-terminale Metodo di Sanger Fluorimetria NO2 Cromatografia NO2 F 2,4 Dinitro-fluoro-benzene FDNB

Step 4: Determinazione composizione amminoacidica 1 2 3 4 5 Metodo di Edman Step 4: Determinazione composizione amminoacidica 1 2 3 4 5 Marcatura Primo ciclo 1 2 3 4 5 Rilascio 2 3 4 5 1 Marcatura 2 3 4 5 Secondo ciclo Rilascio 2 3 4 5

Feniltioidantoin derivato dell’amminoacido Polipeptide TFA - H2O 1 N O S R H Fenitiocarbamilpeptide Feniltioidantoin derivato dell’amminoacido N-terminale

Specificità di alcuni comuni metodi per frammentare le catene polipeptidiche Tripsina Chimotripsina Staphylococcus aureus Proteasi V8 Bromuro di cianogeno Trattamento Siti di clivaggio Lys, Arg (C) Phe, Trp, Tyr (C) Asp, Glu (C) Met (C)

Esempio di una digestione enzimatica con tripsina N-Asp-Ala-Gly-Arg-His-Cys-Lys-Trp-Lys-Ser-Glu-Asn-Leu-Ile-Arg-Thr-Tyr-C Tripsina N-Asp-Ala-Gly-Arg His-Cys-Lys-Trp-Lys Ser-Glu-Asn-Leu-Ile-Arg Thr-Tyr-C Step 7: Sequenziamento mediante degradazione di Edman

Step 8: Ricostruzione della sequenza Utilizzo di più proteasi che tagliano la proteina in punti di versi in diverse reazioni di digestione Sequenziamento di tutti i peptidi ottenuti (mediante degradazione di Edman) Confronto ed allineamento di tutti i peptidi che si sovrappongono per costruire la sequenza della catena polipeptidica iniziale Digestione triptica: A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K Digestione con V8: F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K-A-E L-V-G-K A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K-A-E F-S-G-I-T-P-K Sequenza corretta: L-V-G-K-A-E-F-S-G-I-T-P-K

Struttura tridimensionale Funzione Sequenza delle proteine Evoluzione Localizzazione cellulare Famiglie di proteine