Ereditarietà X-Linked Madre Padre X X X Y Figlia Figlio

Cromosoma X Cromosoma Y Regione pseudo-autosomica Geni sottoposti ad inattivazione Geni attivi X Inactive SpecificTranscript Xq13 circa 80 geni SRY Geni della spermatogenesi circa 870 geni

Cromosoma Y Delezioni interstiziali dell’Y nel 5-10% dei soggetti con azoospermia o grave oligospermia non ostruttiva

Delezioni del cromosoma Y Le microdelezioni del cromosoma Y rappresentano una causa importante di sterilità maschile con oligo- azoospermia e la loro identificazione fornisce un corretto inquadramento diagnostico permette di evitare trattamenti empirici costosi e inutili ha importanti conseguenze etiche se il paziente è candidato per le tecniche di riproduzione assistita almeno 3 regioni importanti per la spermatogenesi

Casi di azoospermia o oligospermia severa : il 5-10% è portatore di anomalie citogenetiche del cromosoma Y il 5-10% è portatore di delezioni sub-microscopiche di Yq NON sono individuabili all’analisi del cariotipo (microdelezioni) ma possono essere identificate mediante STS-PCR STS “sequence tagged sites” sono sequenze note di DNA genomico che possono essere amplificate tramite PCR

Int J of andrology (1999) – Hum Reprod (2001) Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions M.Simoni et al. elenco di STS da non utilizzare set di STS primers consigliati: AZFa: sY84,sY86 AZFb: sY127,sY134 AZFc: sY254,sY255 Se viene trovata una delezione per valutare la esatta estensione si consiglia l’uso di altri STS che si trovino all’estremità prossimale e distale della regione (particolarmente importante per AZFa e b in pazienti candidati all’ICSI)

Multiplex a sY254 (c) sY 86 (a) sY127 (b)

Multiplex b sY84 (a) sY134 (b) sY255 (c)

Frequenza delle microdelezioni Y estema variabilità tra i vari studi (1%-55%) dipende dai criteri di selezione pazienti azoospermici o gravemente oligospermici (<5 milioni spermatozoi/ml) la percentuale è dell’11% (solo le forme idiopatiche : 18%) se si considerano pazienti con più di 5 milioni di spermatozoi/ml la percentuale è inferiore all’1% Casistica laboratorio Genetica Medica: 1/600 AZFa 2/600 AZFb 12/600 AZFc 6/600 AZFb+c 2/600 AZFa+b+c Tot. 23/600 (3.8%)

AZFa AZFb AZFc DBY - UTY rara USP9Y* RBMY1A DAZ BPY2 CDY1 comune Del interstiziale rara Azoospermia con sole cellule si Sertoli (SCOS) AZFb RBMY1A (multicopia) Arresto della spermatogenesi alla pubertà prima o durante la meiosi AZFc DAZ (4-7 copie) BPY2 CDY1 (2 copie una nel cluster DAZ una all’estremo 3’) interstiziale c comune Presenza di cellule germinali in vario stadio di maturazione ma pochi spermatozoi (periodo fertile giovanile) terminale c intermedia interstiziale bc Fenotipo variabile dalla SCOS alla oligospermia terminale abc Mutazioni puntiformi in USP9Y* in 2 maschi con ipospermatogenesi

Variabilità fenotipica delle delezioni non costante correlazione genotipo-fenotipo in genere: azoospermia (84%) grave oligospermia (meno di 1 x106ml) (14%) moderata oligospermia (1-5 x106ml) (2%) alterazione della spermatogenesi variabile anche in delezioni apparentemente simili del Y anche in azoo- oligospermici con criptorchidismo o varicocele grave del Y può promuovere la perdita del cromosoma con mosaicismo somatico 45X / 46XY del Y molto centromeriche associate a bassa statura

Sex reversal

Inattivazione dell’X solo uno dei due crom. X è attivo nelle femmine meno di 100 cellule propagazione clonale Zigote femminile casuale innattivazione X pat. / X mat. stadio di morula

Inattivazione bilanciata dell’X Cosa succede se una donna porta un gene non funzionante sull’X gene mutato Zigote femminile Innattivazione casuale X paterno / X materno il 50% delle cellule non esprime quel gene

Inattivazione dell’X Compensa le differenze di “dose genica” tra maschi e femmine Alcuni geni sfuggono all’inattivazione (regioni pseudo-autosomiche alle estremità del cromosoma X) I geni XIST-TSIX in Xq13 sono essenziali per l’inattivazione La metilazione è uno dei meccanismi dell’inattivazione

Inattivazione sbilanciata dell’X Perchè ? Un cromosoma X porta una mutazione LETALE C’è una traslocazione bilanciata X ; autosoma La regione che controlla l’inattivazione è alterata E’ avvenuto “per caso”

Inattivazione Sbilanciata dell’X: effetto della selezione gene mutato Zigote femminile Selezione nei tessuti in cui la funzione del gene è indispensabile Inattivazione casuale stadio embrionale

Malattie X-Linked recessive Madre ( portatrice ) Padre X X X Y Femmina Femmina Maschio Maschio SANA PORTATRICE MALATO SANO

Ereditarietà X-Linked recessiva

Ereditarietà X-Linked recessiva

Distrofia Musculare di Duchenne DMD Giorgio Ester Enrico

Giorgio ha 3 anni modesto ritardo nell’iniziare a camminare cammina con lentezza ha difficoltà a stare eretto non corre all’esame obiettivo ipertrofia dei gastrocnemi debolezza dei muscoli prossimali Creatina Kinasi (CPK) = 10,000 ui

Biopsia Muscolare Controllo Normale Giorgio

Colorazione Ab anti-Distrofina Controllo Normale Giorgio

Distrofina proteina associata alla membrana : - il dominio N-terminale lega l’actina - lungo dominio con 24 ripetizioni omologhe ad α-elica - una regione vicina al C-terminale ricca di cisteine che lega il calcio - il dominio C-terminale che lega altre proteine di membrana

Gene DMD 2,4 Mb (12 cMorgan) 8 promotori 79 esoni (0.6%) mRNA 14 kb trascritto in 16 ore DM Duchenne : mancata espressione di distrofina - delezioni molto grandi (65-70%) , duplicazioni (10%) - mutazioni frameshift (10%), stop codon (5%) - delezione “in-frame” con perdita delle regioni C-terminale o N-terminale (domini che legano le proteine) DM Becker : alterata qualità o quantità di distrofina - delezioni “in-frame” (85%) - di cui il 46% nella regione dei “spectrin repeats”

Ricerca diretta delle delezioni nella DMD - preparazione del DNA genomico - amplificazione con PCR multiplex di 9 o più esoni separazione dei frammenti in gel di agarosio visualizzazione con EB e raggi UV - fotografia (o immagine digitale)

Giorgio è affetto da Distrofia Musculare di Duchenne Diagnosi confermata da biopsia muscolare Il test genetico non ha evidenziato delezioni ( delezioni-dupl. sono presenti nel 70% dei malati ) Giorgio ha probabilmente una mutazione puntiforme Malattia X-linked recessiva - incidenza di 1 / 3300 tasso di nuove mutazioni di 10-4 / meiosi (1/3 dei casi)

Albero famigliare allargato dopo colloqui con la cugina Rosa e la zia Giovanna Elena Giovanna Enrico Ester Giorgio Rosa

La cugina Rosa vuol sapere che rischio ha di avere un figlio malato Osservando la famiglia, la probabilità che Rosa sia portatrice è = 25% Ancor prima del test genetico, si può migliorare la stima del rischio ?

Creatina Kinasi (CPK) fuoriesce dalle membrane del muscolo danneggiato molto elevata nei maschi malati livelli elevati solo in 2/3 delle portatrici Giovanna e Rosa hanno CPK normale

Stima “Bayesiana” del rischio Probabilità “complessiva “ : tiene conto della probabilita a priori di essere e di non essere portatore ( appartenendo ad dato albero famigliare ) e di altri fattori che modificano queste due probabilità (prob. condizionali)

Zia Giovanna : ha CPK normale e due figli maschi sani Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale Giovanna Elena

Quale è la probabilità che Zia Giovanna sia portatrice ? Che lo sia Che non lo sia Probabilità “ a priori ” 1 / 2 1 / 2 con CPK Normale ? 1 / 3 1 con 2 figli Maschi Sani ? 1 / 4 1 Prob. condizionale 1/2 .1/3 .1/4 = 1 / 24 1 / 2 Prob. finale 1 : 12 1 / 24 1 / 24 + 1 / 2 = 1 / 13

Cugina Rosa : ha 1/2 della probabilità di Giovanna e CPK normale Elena Giovanna CPK normale Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale

Il rischio a priori per Rosa è la metà di quello di Zia Giovanna 1/13 x 1/2 = 1/26

Quale è la probabilità che Rosa sia portatrice ? Che lo sia Che non lo sia Probabilità “ a priori ” 1/13 .1/ 2 = 1 / 26 25 / 26 con CPK Normale ? 1 / 3 1 Prob. “ a posteriori ” 1/26 .1/3 = 1 / 78 25 / 26 Prob. finale 1 : 75 Che lo sia Che non lo sia Probabilità “ a priori ” 1/13 .1/ 2 = 1 / 26 25 / 26 con CPK Normale ? 1 / 3 1 Prob. “ a posteriori ” 1/26 .1/3 = 1 / 78 25 / 26 Prob. finale 1 : 75 1 / 78 1 / 78+25 /26 = 1 / 76

Probabilità che Rosa possa avere un figlio affetto Prob. di essere portatrice X rischio di trasmissione 1/ 76 x 1/4 = 1 / 304

1/304 è la probabilità che la cugina Rosa possa avere un figlio affetto Elena Giovanna CPK normale (1/13) Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale (1/76)

Uso del Linkage nella malattia DMD ( mutazione non trovata ) Elena Giovanna Enrico Ester Giorgio Rosa

Analisi di linkage Linkage = concatenazione Alleli corrispondenti a loci tra loro vicini sullo stesso cromosoma tendono ad essere trasmessi insieme (come una singola unità) durante la meiosi Allele 2 Gene wt Allele 1 Allele 1 locus polimorfico A (1, 2, 3, 4) Gene con mutazione Allele 3 locus polimorfico B (1, 2, 3, 4, 5)

Analisi di linkage La frequenza di ricombinazione 2 wt 1 1 Mut 3 La frequenza di ricombinazione è una “misura della distanza” tra loci diversi : = 0.5 (50%) loci lontani = 0 (0%) loci vicinissimi = 0.02 (2%) loci vicini unità di misura = centiMorgan cM = 1 ricombinazione/100 meiosi 1 wt 2 Mut 3

Esempio di marcatori polimorfici impiegati nel linkage della DMD 2,4 Mb (12 cMorgan) 3’ Esone 79 Microsatellite D: 1, 2, 3, .... 6 alleli Microsatellite C G E N E DMD Microsatellite B Esone 1 Microsatellite A: 1, 2, 3, ..... 10 alleli 5’

Uso del Linkage: 1 marcatore (A) 5’ UT ( e se ci fosse una ricombinazione tra mut. e marcatore? ) Enrico Ester Giorgio Rosa Giovanna Elena 1 7 3

Uso del Linkage: 2 marcatori (A + D) ( c’è stata ricombinazione tra mut. e marcatore ? ) Enrico Ester Giorgio Rosa Giovanna Elena 1 7 3 4 5 6

Uso del Linkage: 2 marcatori (A + D) Sarà stata trasmessa la mutazione ad Ester ? Elena Giovanna 2 5 4 6 5 4 9 7 1 3 7 1 Enrico Ester Giorgio Rosa 2 4 4 5 6 9 7 1 7 3

1 e 2 ricombinazioni tra marcatori mut 1 mut 1 mut 1 2

Esempio di marcatori polimorfici impiegati nel linkage della DMD 2,4 Mb (12 cMorgan) 3’ Esone 79 Microsatellite D: 1, 2, 3, .... 6 alleli Microsatellite C 0.124 = 0.0002 4 ricombinazioni in 1 su 5000 casi G E N E DMD Microsatellite B Esone 1 Microsatellite A: 1, 2, 3, ..... 10 alleli 5’

Se il marito di Rosa avesse un aplotipo 4-1 ?? Nuove mutazioni 10-4 / meiosi (1/3 dei casi) Elena Giovanna 5 4 6 5 4 7 1 3 7 1 Enrico Ester Giorgio Rosa 1 4 4 5 6 1 7 3

Analisi del rischio in famiglie X-linked Informazioni dall’albero famigliare Calcolo del rischio secondo Bayes Ricerca della mutazione (test diretto) Uso del linkage (test indiretto) Attenzione alle ricombinazioni ! ( usare più marcatori… meglio se intragenici )

Caso negativo per delezioni e duplicazioni DMD 5’DYS-II 1.2 kb a monte dell’esone 1 5’-5N3 introne 1 5’-7n4 introne 25 STR44 13.8 kb a valle dell’esone 44 STR45 1.2 kb a valle dell’esone 45 STR49 introne 49 DMD1-2c introne 56 DXS1214 introne 62 3’DYS MS esone 79

determinazione del sesso (SRY) informativa solo la trasmissione Xp 5’DYS-II 1.2 kb a monte dell’esone 1 5’-5N3 introne 1 5’-7n4 introne 25 STR44 13.8 kb a valle dell’esone 44 STR45 1.2 kb a valle dell’esone 45 STR49 introne 49 DMD1-2c introne 56 DXS1214 introne 62 3’DYS MS esone 79 In caso di gravidanza: villocentesi in 11ma set determinazione del sesso (SRY) informativa solo la trasmissione Xp

introne 1 - 25 esone 63 - 79 111223221