Progetto Lauree Scientifiche CONVITTO NAZIONALE “Vittorio Emanuele II” LICEO CLASSICO EUROPEO - LICEO SCIENTIFICO Progetto Lauree Scientifiche ‘’Bacillus clausii’’

Modelli matematici Come si realizza? Cos’è un modello matematico? Il modello matematico è una descrizione semplificata di fenomeni reali espressi in termini matematici. Trovano la loro applicazione in vari campi come la biologia, la meteorologia, la climatologia e l’economia. Osservazione di un fenomeno; Selezione dei parametri rilevanti; Formulazione delle equazioni; Analisi delle equazioni stesse; Confronto con i dati sperimentali.

Prima fase: osservazione del fenomeno L’osservazione del fenomeno è effettuata attraverso misure, rilevazioni, esperimenti, censimenti… Nel nostro caso si è osservata la crescita di organismi cellulari effettuata in laboratorio.

Seconda fase: selezione dei parametri rilevanti La legge di crescita batterica permette di individuare immediatamente i parametri rilevanti: 𝑎𝑛= popolazione al tempo 𝑡=𝑛 (con 𝑎𝑛≥0); 𝑡 =tempo definito come “salto generazionale”; 𝑉 𝑛, 𝑚 = velocità media definita come rapporto tra la variazione di popolazione e il tempo in cui avviene 𝑉 𝑛, 𝑚 = ( 𝑎 𝑛+1 – 𝑎 𝑛 ) 1

Terza fase: formulazione dell’equazione A questo punto si tenta di costruire un modello, ipotizzando che la variazione della popolazione batterica sia proporzionale alla popolazione stessa al tempo 𝑛. Detto tasso di crescita: 𝑘 𝑛 = 𝑉𝑚 𝑎 𝑛 = 𝑎 𝑛+1 – 𝑎 𝑛 𝑎 𝑛 Si ottiene: 𝑎 𝑛+1 = (1+ 𝑘 𝑛 ) 𝑎 𝑛 Equazione alle differenze che rappresenta un possibile modello che varia in base al tasso di crescita.

Terza fase: formulazione dell’equazione Studiamo il comportamento del modello in base al tasso di crescita. Se il tasso è costante, ovvero: 𝑘 𝑛 =𝑘 il modello che otteniamo è: 𝑎 𝑛+1 =(1+𝑘) 𝑎 𝑛 𝑎 0 =𝑎 che viene detto ‘’modello di Malthus’’ o di crescita geometrica.

Terza fase: formulazione dell’equazione Se invece il tasso di crescita è dato da 𝑘 𝑛 =ℎ 𝑀− 𝑎 𝑛+1 dove 𝑀 rappresenta la ‘’capacità di accoglienza dell’ambiente’’ il modello diventa 𝑎 𝑛+1 − 𝑎 𝑛 =ℎ(𝑀− 𝑎 𝑛+1 ) 𝑎 𝑛 𝑎 0 =𝛼 Che si può chiamare ‘’logistico’’

Quarta fase: analisi delle equazioni stesse Formulato il modello, proviamo a studiarlo. Nel caso del modello di Malthus, utilizzando il principio di induzione, si ottiene: 𝑎 𝑛 = (1+𝑘) 𝑛 𝛼 Il comportamento della popolazione dipende da k.

Quarta fase: analisi delle equazioni stesse Osserviamo ora il comportamento dell’equazione al variare di 𝑘 . Dovendo essere 𝑎𝑛 ≥0per ogni 𝑛 ≥0 Deve essere 𝑘 ≥−1 ma 𝑘=−1 comporta 𝑎𝑛 =0 per ogni 𝑛≥0 quindi non si considera; 𝑘=0 comporta 𝑎𝑛 = 𝑎0 costantemente “crescita zero”; 𝑘>0 ⇒ 𝑘+1>1⇒ popolazione in crescita; −1<𝑘<0⇒0<𝑘+1<1⇒ popolazione in diminuzione.

GRAFICI DI CRESCITA GEOMETRICA

Quarta fase: analisi delle equazioni stesse Nel caso del modello logistico, effettuando opportuni calcoli, si ottiene 𝑎 𝑛 = 𝑎 0 𝑀 (1+ℎ𝑀) 𝑛 𝑀− 𝑎 0 + 𝑎 0 (1+ℎ𝑀) 𝑛 I punti della successione 𝑎 𝑛 si trovano su una curva detta ‘’curva logistica‘’o sigmoide, che descrive una curva ad S di crescita di alcuni tipi di popolazioni P. All'inizio la crescita è quasi esponenziale, successivamente rallenta, diventando quasi lineare, per raggiungere una posizione asintotica dove la crescita è molto lenta.

Grafico di una curva logistica

Quinta fase: confronto con i dati sperimentali A questo punto si confrontano i dati determinati con le equazioni formulate con i dati ottenuti sperimentalmente. Troveremo che il nostro modello rientra nel modello logistico, come si vedrà dal grafico ottenuto con le misurazioni effettuate.

Costruzione della curva di crescita del Bacillus clausii Scopo: verificare la crescita esponenziale del numero di unità formanti colonie (U.F.C.) in una coltura di un probiotico Richiami teorici: il B. clausii è un microrganismo Gram- positivo, mobile, sporigeno e aerobio. Esso vive nel suolo e viene utilizzato come probiotico. È a forma di bastoncello e cresce in gruppi o in colonie. È alcalofilo (vive in ambienti alcalini o basici). È capace di produrre alcune proteasi (subtilisine) attive in ambienti alcalini.

Le spore sono in grado di germinare, generando le forme vegetative, se vengono mantenute per almeno 12 ore a 40 ° 𝐶 in un brodo di coltura come l'acqua peptonata oppure se vengono poste direttamente su un terreno solido come il Plate Count Agar. Il tempo medio di generazione del Bacillus clausii è di circa 30 minuti.

L'intorbidimento dell'acqua peptonata dimostra la germinazione delle spore di B. clausii. Acqua peptonata pura Acqua peptonata con batteri Bagnetto termostatato

La comparsa di colonie, cremose e di color avorio, leggermente in rilievo, di forma tondeggiante, con margini netti dimostra la germinazione delle spore sul terreno solido utilizzato.

Strumenti e materiali adoperati Pipette Pasteur Provette Becher Termometro Capsule di Petri Spatola Bagnetto termostatato Stufa termostatata Distillatore Becco di Bunzen Spargifiamma Contacolonie Piastra riscaldante Imbuto Bilancia analitica MATERIALI Spore di Bacillus clausii Soluzione fisiologica Acqua distillata Acqua peptonata Plate Count Agar Trypton Soy Agar Corrente elettrica

Procedimento operativo PREPARAZIONE DEL BRODO DI COLTURA Distillare 150 ml di acqua (fig. 1) Pesare sulla bilancia analitica 2,25 grammi di acqua peptonata liofilizzata (fig. 2) Sciogliere la polvere pesata in 150 ml di acqua distillata (fig. 3) Riscaldare leggermente agitando di frequente e sterilizzare mediante pastorizzazione (fig. 4) Versare nelle provette (fig. 5)

Fig. 1 Fig. 2 Fig. 5 Fig. 3 Fig. 4

PREPARAZIONE DEL TERRENO DI COLTURA Distillare 150 ml di acqua (fig. 6) Pesare sulla bilancia analitica 3,525 g di Plate Count Agar liofilizzato (fig. 7) Sciogliere la polvere pesata in 150 ml di acqua distillata (fig. 8) Riscaldare agitando frequentemente (fig. 9) Lasciar bollire per un minuto per sterilizzare mediante pastorizzazione (fig. 10) Versare nelle capsule di Petri (fig. 11)

Fig. 6 Fig. 7 Fig. 9 Fig. 8 Fig. 10 Fig. 11

Procedere analogamente fino ad ottenere la diluizione 1: 10 7 . Per ottenere colonie singole facilmente contabili è necessario sottoporre il campione di partenza a diluizioni successive in modo da ridurre la concentrazione delle cellule. Preparare le diluizioni decimali a scalare in questo modo: miscelare il campione in esame per distribuire uniformemente i microrganismi e trasferire, con pipetta sterile, 1 ml del campione nella prima di una serie di provette contenenti 9 ml di soluzione fisiologica, omogeneizzando il campione nel diluente (fig. 12). Si ottiene in tal modo la diluizione 1:10. Procedere analogamente fino ad ottenere la diluizione 1: 10 7 .

Fig. 12

PIASTRATURA (PER INCLUSIONE) Prelevare 1 ml dall'ultima diluizione e versarlo in una capsula di Petri Versare l'Agar mantenuto fuso a 45 ° 𝐶 , nella capsula di Petri (fig. 13) Ruotare delicatamente la piastra per miscelare il terreno Aspettare la solidificazione del terreno Capovolgerlo e incubarlo nella stufa termostata a 40 ° 𝐶 (fig. 14) Dopo la fase di latenza durata circa 7 ore, si iniziano a contare le U.F.C ad intervalli regolari di 30 minuti

Fig. 13 Fig. 14

CONTEGGIO IN PIASTRA Il metodo della conta in piastra presenta un elevato grado di sensibilità permettendo di rilevare un numero piccolo di organismi presenti nella sospensione. La possibilità di registrare un numero di microrganismi il più vicino possibile al numero reale dipende da una serie di fattori soprattutto di tipo operativo. La crescita in piastra richiede tempi di attesa piuttosto lunghi determinati dalla durata dell'incubazione necessaria per evidenziare colonie visibili. Il numero di microrganismi viene determinato moltiplicando il numero di colonie per l’inverso del fattore di diluizione.

Conteggio in piastra Visuale del contacolonie

I primi risultati ottenuti sono stati i seguenti: RISULTATI CONTEGGIO I primi risultati ottenuti sono stati i seguenti: 𝑡 0 :(38±1)× 10 6 U.F.C./1 ml 𝑡 1 :(80±1)× 10 6 U.F.C./1 ml 𝑡 2 :(152±1)× 10 6 U.F.C./1 ml 𝑡 3 :(272±1)× 10 6 U.F.C./1 ml 𝑡 4 :(416±1)× 10 6 U.F.C./1 ml

Otteniamo i seguenti risultati: Rieseguiamo le diluizioni, la piastratura e il conteggio una seconda volta. Otteniamo i seguenti risultati: FASE DI LATENZA (7 ORE) : 40 U.F.C./1 ml 𝑡 0 : 1760 U.F.C./1 ml 𝑡 1 : 3530 U.F.C./1 ml 𝑡 2 : 7020 U.F.C./1 ml 𝑡 3 : 14060 U.F.C./1 ml 𝑡 4 : 28160 U.F.C./1 ml 𝑡 5 : 56500 U.F.C./1 ml 𝑡 6 : 112600 U.F.C./1 ml 𝑡 7 : 225270 U.F.C./1 ml 𝑡 8 : 275560 U.F.C./1 ml 𝑡 9 : 285060 U.F.C./1 ml

CONCLUSIONI Utilizzando i valori di U.F.C. nel tempo si ottiene il grafico seguente: si evidenzia una lunga fase di latenza dovuta, probabilmente, alla germinazione delle spore e all'adattamento delle cellule batteriche al terreno di coltura; alla fase di latenza segue una fase di crescita in cui il numero di U.F.C. aumenta rapidamente nel tempo. Gli ultimi due punti del grafico evidenziano un numero molto simile di U.F.C. Il numero delle colonie non aumenta, poiché è stato raggiunto un equilibrio tra le colonie che sopravvivono e quelle che muoiono. Se avessimo proseguito nel contare le colonie, avremmo notato una diminuzione nel numero di U.F.C. dovuta all’aumento del numero di colonie morte a scapito di quelle vive.

Curva di crescita di Bacillus clausii

Maria Cristina D’Alessandro Giulio Cristian D’Anna Flavia Martinelli CONVITTO NAZIONALE “Vittorio Emanuele II” LICEO CLASSICO EUROPEO - LICEO SCIENTIFICO Prof.ssa Annamaria Salvemini A cura di: Giulia Andreucci Maria Cristina D’Alessandro Giulio Cristian D’Anna Flavia Martinelli Filomena Pellino Anna Maria Petrone Ramona Raiola Maria Sofia Troise Hanno collaborato realizzando l’esperimento gli allievi della classe III LS e la prof.ssa Maria Pia Di Grado. Realizzazione grafica e stesura della sezione scientifica a cura di Emanuele Rossitto