Metodi per studiare l’espressione dei geni Northern blot Trascrittasi Inversa -PCR (RT-PCR) Ibridazione In situ Trascrizione In vitro DNA Microarray

Purificazione dell’RNA Procedura Lisi delle cellule con un reagente che dissocia le nucleoproteine e inibisce la RNAsi Rimozione delle proteine Precipitazione specifica dell’RNA

Northern blot Per determinare la dimensione e la quantita’ di specifici mRNA Studi sull’espressione genica

Northern blot Elettroforesi dell’RNA in gel contenente formaldeide per mantenere l’RNA in forma completamente lineare Trasferimento dell’RNA su una membrana Ibridazione con una sonda marcata

+ - tampone elettroforetico 100V 0,2A + - generatore di corrente gel di agarosio scatola elettroforetica tampone elettroforetico es. TAE (4mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8.0)

Separa le molecole in base alla dimensione Gel Elettroforesi- Separa le molecole in base alla dimensione

Trasferimento su supporto solido

Trasferimento dal gel alla membrana

Preparare la sonda per il Northern Blot

Ibridazione La sonda marcata e’ aggiunta ad una soluzione contenente il supporto solido che lega l’RNA da analizzare

Lavaggio Rimozione della sonda non legata al supporto solido

Rivelazione degli ibridi Esposizione di un film se la sonda e’ marcata radioattivamente Se la sonda e’ marcata con un enzima si procede alla reazione enzimatica che produce colore direttamente sul supporto solido

Dopo il trasferimento gel membrana

Northern blot La rivelazione avviene usando: DNA marcato con radioattivo(32P) DNA marcato con un enzima che catalizza una reazione che produce luce o colore

Northern blot Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae total RNA from leaves (L), germinating seeds (Se), roots (Ro) and stems (St). The blot was hybridized with probes for ElLTP1 (top panel) and ElLTP2 (middle panel). The bottom panel shows ethidium bromide staining of the gel before blotting. The numbers to the left indicate approximate transcript sizes in kb

Svantaggi del Northern Blot Richiede grandi quantita’ di RNA E’ un processo lungo e laborioso

Trascrittasi Inversa-PCR Rivelazione di mRNA molto rari Analisi di RNA con pochissime quantita’

Procedura Purificazione dell’RNA Aggiungere i primer mescolare RNA con la trascrittasi inversa per effettuare la sintesi del primo filamento di cDNA Aggiungere la DNA polimerasi termostabile per effettuare la sintesi del secondo filamento di cDNA e per amplificarlo con i cicli della PCR

Trascrittasi inversa - PCR (RT-PCR) mRNA 5’ AAAAA 3’ Primer 1 3’ TTTTT 5’ reverse transcriptase (RNA-dependent DNA polymerase) mRNA 5’ AAAAA 3’ cDNA 3’ TTTTT 5’ Remove RNA (RNase A) cDNA 3’ TTTTT 5´ Add PCR primers Primer 2 5’ 3’ TTTTT 3’ 5’ Primer 3 Add Taq polymerase. Run PCR

Reverse transcriptase-PCR (= RT-PCR) Epoxide hydrolase + + + + - - - - RT l l se r st l se r st pl 2027 1904 1584 947 831 564

Ibridazione dell’RNA in situ Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi su vetrini da microscopio Preparation of RNA probe with in vitro transcription T7/T3 or SP6 promoter

RNA in situ hybridization Colour substrate: nitro blue tetrazolium (NBT) + 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense (a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1. E. lagascae seedlings were collected 7 days after sowing. co Cotyledon, en endosperm, hy hypocotyl, am apical meristem, ro root

Northern blotting RNA isolation Probe labeling Gel electophoresis AAAAAA Probe labeling pBS-SemaIII dATP dGTP dTTP dCTP Gel electophoresis Hybridization Blotting Autoradiography Northern blotting allows easy and more or less quantitative detection of a limited number of transcripts. Total RNA (or mRNA) is separated on an agarose gel and transferred to a nylon membrane. This membrane is then incubated with a radiolabeled probe derived from the gene of interest. After hybridization, size and amount of the corresponding transcript in the RNA pool are revealed by autoradiography. The method is not very sensitive.

reverse Northern blotting Reverse Northern blotting is the opposite of Northern blotting. Here, specific probes are immobilized on a nylon membrane and subsequently hybridized to radiolabeled cDNA derived a pool of mRNA. Multiple identical membranes can be hybridized with different cDNA pools, and the relative intensity of the hybridization signal for each spot will reveal the extent of regulation of the corresponding transcripts. This method depends has evolved into the modern cDNA macro and micro array techniques.

cDNA arrays (continued) macro-arrays low-density filter-supported radioactive probes (duplicates) low sensitivity only cDNA clones spotted cheap cDNA arrays were discussed in detail by Sabine Spijker.

cDNA arrays (continued) micro-arrays high-density glass-supported fluorescent probes (single slide) high sensitivity ability to spot oligonucleotides very expensive cDNA arrays were discussed in detail by Sabine Spijker.

I microarrays Tessuto della prostata, normale Tessuto della prostata, tumorale Un microarray è un supporto solido sul quale sono stati posizionati diverse migliaia di cDNA in spot separati. Ciascuno spot rappresenta un gene, in quanto contiene numerose copie di un cDNA corrispondente a tale gene. In questo esempio i cDNA sono stati posizionati su di un vetrino, simile ai normali vetrini usati per l’istologia.

Microarray technology Probes Microarray synthetized by photolithography or EST/oligo “linking” http://www.ym.edu.tw/excellence/HBP/HBP_CP4/procedure.htm

utilizzo dei microarrays Tessuto della prostata, normale utilizzo dei microarrays Tessuto della prostata, tumorale si confrontano i profili di espressione genica di due campioni differenti. E’ necessario estrarre le molecole di mRNA dai due campioni.

Confronto dei profili di espressione genica in due campioni cellulari diversi Estrazione dell’mRNA dai 2 campioni di cellule che si vogliono confrontare (1) (2) Conversione in cDNA (6) Immagine a colori raffigurante il microarray Marcatura con 2 fluorocromi diversi (3) Eccitazione della fluorescenza tramite laser (4) (5) Riconoscimento tra i cDNA provenienti dai 2 campioni e quelli già presenti sul microarray

Confronto dei profili di espressione genica in due campioni cellulari diversi I puntini gialli corrispondono a geni che sono espressi in uguale quantità nei due campioni. I puntini verdi corrispondono a geni maggiormente espressi nel campione marcato col fluorocromo che emette fluorescenza verde (ad esempio nelle cellule normali). I puntini rossi corrispondono a geni che sono maggiormente espressi nel campione marcato col fluorocromo che emette fluorescenza rossa (ad esempio nelle cellule tumorali).