Scopi della analisi molecolare

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Con la tecnica della PCR si può amplificare in modo specifico e ripetitivo qualsiasi segmento di DNA compreso tra due particolari sequenze nucleotidiche.
Tecnica della PCR (Polymerase Chain Reaction) Serve a identificare e amplificare (produrre copie) di una sequenza specifica dI DNA (gene) Utilizza: primer.
ESERCITAZIONI ANTROPOLOGIA POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR)
ENTRIAMO IN LABORATORIO
I TEST GENETICI.
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI Polymerase Chain Reaction (PCR)
I TEST GENETICI.
Transcript della presentazione:

Scopi della analisi molecolare Conferma della diagnosi clinica nei pazienti affetti Ricerca dei portatori sani Diagnosi prenatale

Patologia Genetica Patologia Monogenica: Patologia Poligenica: malattie dovute a mutazioni di un singolo gene Patologia Poligenica: malattie dovute a mutazioni di più geni, generalmente con presenza di una componente ambientale Patologia Cromosomica: malattie dovute ad alterazioni numeriche o strutturali del cariotipo

Il cariotipo: una sola analisi per diverse patologie

Analisi molecolare: una analisi specifica per una specifica patologia

Tutto inizia dal DNA Molecola depositaria del patrimonio genetico Trasporta l' informazione genetica necessaria alla trasmissione dei caratteri ereditari http://learn.genetics.utah.edu/

Campioni da cui si può estrarre DNA Una goccia di sangue Saliva presente su una sigaretta o su un chewing-gum Tracce di sperma Urine e feci Un capello Fossili Mummie

Estrazione di DNA Varie metodiche per estrazione DNA Estrazione manuale: vari kit in commercio ( spin basket, biglie magnetiche) Estrattori automatici

Estrazione Dna da sangue mediante Kit commerciali Campione di sangue in EDTA Aliquotare 200μl di Binding Buffer Aggiungere 40 μl di proteinasi K Vortexare ed incubare per 10 min a 72° C in termoblocco Spinnare Aggiungere 100μl di isopropanolo Assemblare il filtro High Pure con una provetta relativa Pipettare il campione nel serbatoio superiore e centrifugare per 1 min Successivi lavaggi con Inibitor Remaval e con Wash Buffer Aggiungere 200μl di Elution Buffer Centrifugare per 1 min e raccogliere il DNA

Reazione a catena della polimerasi (PCR) Mezzo rapido ed economico per ottenere grandi quantità (amplificazione) di una specifica sequenza di DNA o RNA Sfrutta la capacità della polimerasi di catalizzare la sintesi di acidi nucleici a partire da un filamento stampo

PCR: 3 Fasi Denaturazione : apertura doppia elica Annealing : attacco dei primers Extension : copiatura da parte della Taq polimerasi

Reazione di Polimerizzazione a Catena (PCR)

Reagenti necessari per la PCR DNA Primers Oligonucleotidi Taq polimerasi Baffer e Magnesio H2O Ciclo standard di PCR 94°C 10 m 1 ciclo 35 cicli 72°C 10 m 1 ciclo 94°C 30s 58°C 30s 72°C 30s

Preparazione di una PCR http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/ http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm

Verifica prodotti di PCR mediante elettroforesi di acidi nucleici Migrazione di ioni o molecole sottoposte ad un campo elettrico applicato Permette di separare i frammenti amplificati mediante PCR

Elettroforesi su gel Si preparano i gel di agarosio che costituiscono una “matrice a setaccio” Ad un’estremità del gel vengono “caricati” i campioni da analizzare e viene applicato un campo elettrico La direzione di migrazione dipende dalla carica delle molecole: gli acidi nucleici, carichi negativamente, migreranno verso il polo positivo La velocità di migrazione dipende dalla dimensione del frammento di acido nucleico Si ottiene quindi la separazione dei frammenti di DNA o RNA esclusivamente sulla base delle loro dimensioni (peso molecolare)

Sequenziamento diretto del DNA Metodo accurato per ottenere informazioni precise e definitive su un gene Metodo ideale per la rilevazione di mutazioni difficilmente evidenziabili e di mutazioni puntiformi

Sequenza di DNA

Mutazione in eterozigosi

MUTAZIONE IN OMOZIGOSI

Analisi di frammenti Riconoscimento di paternità Identificazione di autori di reati Identificazione di vittime di reati o sinistri