(dallo Statuto dell’A.M.C.L.I., 1989) La MICROBIOLOGIA CLINICA è una “…disciplina medica finalizzata allo studio, alla diagnosi ed alla terapia delle malattie dell’uomo causate direttamente o indirettamente da microorganismi….” (dallo Statuto dell’A.M.C.L.I., 1989) Franco Alberton

Il microbiologo clinico svolge quindi un’attività sanitaria che ha incidenza sulla salute e che può causare danni temporanei o permanenti alla persona Franco Alberton

Tra i compiti del microbiologo clinico vi è quello di isolare e identificare i microorganismi dei campioni che gli pervengono determinare la loro suscettibilità ai chemioterapici Franco Alberton

RESPONSABILITA’ e può dar luogo a… Nell’ambito dell’attività del microbiologo clinico l’esecuzione dell’antibiogramma riveste una particolare importanza e può dar luogo a… RESPONSABILITA’ Franco Alberton

il MICROBIOLOGO ha il compito (e la RESPONSABILITA’) di fornire dati Tenuto conto che…. LA RESPONSABILITA’ della scelta terapeutica è a carico del CLINICO il MICROBIOLOGO ha il compito (e la RESPONSABILITA’) di fornire dati AFFIDABILI ESAURIENTI CONDIVISI

AFFIDABILI Cioè ricavati a seguito di procedimenti manuali o automatici corretti e verificati

CONDIVISI Cioè illustrati, commentati e discussi con il clinico NECESSITA’ di un rapporto di stretta collaborazione tra microbiologo e clinico

INTERPRETAZIONE CRITICA DELL’ANTIBIOGRAMMA ESAURIENTI Cioè completi di integrazioni nei riguardi di possibili scelte alternative (secondo necessità) INTERPRETAZIONE CRITICA DELL’ANTIBIOGRAMMA

La Richiesta di Esame colturale con Antibiogramma Le domande che vengono poste: Qual'è il patogeno in causa ? La terapia empirica impostata è efficace anche sul patogeno isolato ? Quali sono i farmaci che posso utilizzare in alternativa alla terapia empirica ? Meno tossici Per via orale

Errori indotti dall'Antibiogramma Microrganismo isolato di dubbio significato clinico Ritardi diagnostici Terapie non necessarie Errata interpretazione dell'Antibiogramma Da parte del Laboratorio Mancata segnalazione di ESBL Mancata correzione dei beta-lattamici S per un ceppo di MRSA Da parte del Clinico Erronea assunzione di efficacia di una molecola di classe analoga a quella saggiata

L'antibiogramma premesse teoriche Lo scopo (e la pretesa) principale dell'antibiogramma è quello di predire il risultato clinico di un trattamento antimicrobico con il farmaco saggiato 1 1

L'antibiogramma premesse teoriche Si basa sulla presunzione che la misura in vitro dell’attività dei farmaci antimicrobici sui batteri isolati dalla sede dell’infezione si possa misurare in condizioni che simulano quelle che ci sono in vivo 1 1

L'antibiogramma premesse teoriche Con trattamenti a dosi raccomandate: 1) il risultato “sensibile” implica che c’è un’alta probabilità che il paziente risponda alla terapia 2) il risultato “resistente” implica che il trattamento molto probabilmente fallirà 1 1

L'antibiogramma premesse teoriche Resistenti si definiscono quei microrganismi che non sono inibiti dalle usuali concentrazioni sistemiche raggiungibili dal farmaco somministrato alle previste posologie 1 1

L'antibiogramma premesse teoriche Il risultato Intermedio definisce quei microrganismi che possono essere trattati con quell'antibiotico a un dosaggio piu' alto dell’ usuale. In questo caso l'antibiotico si puo' usare   nel trattamento di infezioni di quei distretti dove si raggiungono concentrazioni più elevate (come ad esempio nell'urina) o quando un alto dosaggio puo' essere utilizzato senza che si raggiungano livelli tossici . 1 1

L'antibiogramma premesse teoriche Vari fattori concorrono al processo di guarigione e sono riassumibili come: fattori legati all’ospite Fattori legati al microrganismo fattori legati al farmaco pertanto è bene ricordare che la correlazione in vitro in vivo non è assoluta 23 22

Ospite malattia di base stato immunitario sede e natura dell'infezione (ascessi, corpi estranei ecc.) diminuita penetrazione aumentata eliminazione 25 24

Microrganismo virulenza e carica batterica superinfezione infezione polimicrobica sviluppo di R durante la terapia 26 25

Farmaco legame alle proteine / biodisponibilità via di somministrazione e dose compartimenti fisiologici attività nella sede dell' infezione 24 23

Discordanze dovute ad errori Laboratorio (isolamento, identificazione, antibiogramma ) Interpretazione clinica (microrganismo non correlato alla malattia ) Dose inappropriata (errore di posologia) 23 22

L'antibiogramma premesse teoriche Considerando questi fattori si è rilevato che la correlazione in vitro in vivo corrisponde circa al 90 – 95 % in caso di risultato “R” al 75 – 80 % in caso di risultato “S” 23 22

Test di sensibilità indicazioni all’esecuzione rilevanza clinica del germe assoluta o relativa alla sede non è prevedibile la sua sensibilità Enterobatteri, Piocianeo, Stafilococchi, Enterococchi ecc. 27 26

Test di sensibilità esecuzione non necessaria e non eseguibile sensibilità nota e costante del microrganismo S. pyogenes e penicillina risposta clinica non correla con il risultato in vitro Listeria, Legionella, Nocardia, Salmonella e aminoglicosidi, Enterococco e cefalosporine e aminoglicosidi, Bacillus sp. Corynebacterium sp. Esecuzione “impossibile” nella routine Clamidia ed altri non coltivabili nei comuni terreni per batteri e/o metodiche molto indaginose 28 27

Lista degli antibiotici da saggiare . La scelta delle molecole deve tener conto di vari fattori sede infezione attività clinica nota verso quel gruppo di microrganismi numero (ragionevolmente limitato) tossicità costo induzione resistenze

Risultati il risultato può essere espresso come qualitativo (S, I, R) quantitativo (concentrazione minima inibente CMI o MIC) qualitativo e quantitativo 3 3

CMI = la più bassa concentrazione che inibisce la crescita in vitro 0.25 1 2 4 8 16 32 0.5 K+ CMI La tecnica della diluizione in brodo determina accuratamente la CMI . Si parte da un inoculo batterico di 5 x 100000 organismi/ml in brodo nutritivo che vengono posti in una serie di provette o pozzetti che contengono diverse concentrazioni di antibiotico. Dopo incubazione di 18-24 ore otteniamo i risultati : la concentrazione di antibiotico presente nel primo pozzetto in cui non si ha crescita batterica definisce la CMI 1 1

Test di sensibilità significato della CMI Il valore di CMI ha significato solo se correlato : alla famacodistribuzione nell’organismo alla classe di appartenenza alla tossicità non possiamo in termini assoluti giudicare migliore il farmaco con CMI più bassa 48 48

Test di sensibilità interpretazione del risultato quantitativo Antibiotico A CMI 0,5 = S 200 mg Conc. ematica 2 Tossicità : rene, orecchio Antibiotico B CMI 4 = S 1000 mg Conc. ematica 16 Tossicità : assente/bassa 42 42

Test di sensibilità significato della CMI Ad avere importanza non è la CMI in assoluto quanto il suo rapporto con la concentrazione dell’antibiotico raggiungibile nel sito dell’infezione Quanto maggiore è questo rapporto tanto maggiore è la probabilità di guarigione

Pseudomonas aeruginosa 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 Piperacillina Ceftazidime Cefepime Imipenem Meropenem Aztreonam Gentamicina Tobramicina Amikacina Ciprofloxacina Levofloxacina Si facilita la scelta della migliore combinazione di antibiotici

Pseudomonas aeruginosa 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 Piperacillina Ceftazidime Cefepime Imipenem Meropenem Aztreonam Gentamicina Tobramicina Amikacina Ciprofloxacina Levofloxacina R I Si facilita la scelta della migliore combinazione di antibiotici

Referto : risultati espressi in altri termini Non sempre il risultato ad un antibiotico è espresso come CMI o R, I, S in modo diretto, ma indirettamente come comportamento nei confronti di un “marcatore” predittivo della sua attività. Betalattamasi Oxacillina ESBL

Marcatori di resistenza per stafilococco Nel caso dello stafilococco le dizioni “betalattamasi +/-” e/o “oxacillina R/S” significano : Betalattamasi + = resitenza a tutte le penicilline Oxacillina / meticillina R = resistenza a tutti gli antibiotici betalattamici (penicilline, cefalosporine ecc..) anche se associati ad acido clavulanico o sulbactam o tazobactam

Marcatori di resistenza per enterobatteri Nel caso di enterobatteri può apparire nell’antibiogramma la dizione “ESBL +” ESBL+ indica la produzione di enzimi (extended spectrum betalactamases) che comportano resistenza in vivo a tutte le cefalosporine di 3° generazione (ceftriaxone,ceftazidime…) ed aztreonam

Equivalenza e comparabilità dei farmaci antimicrobici Possibilità di scelta in alcune classi molto vasta Non è possibile né logico saggiarli tutti La scelta di quelli da inserire nel test è difficile o impossibile (sistemi commerciali chiusi) Introduzione del concetto di “raggruppamento per spettro di azione” di farmaci equivalenti o comparabili nell’uso clinico VEDI FILE ALLEGATO CON I PRINCIPALI ESEMPI

Test di sensibilità : scelta della terapia La scelta dei farmaci fra quelli indicati come “S” dovrebbe quindi essere operata dal clinico seguendo principalmente le seguenti caratteristiche concentrazione nel sito di infezione specie microbica caratteristiche dell’ospite molecole( nuove o vecchie ) caratteristiche di farmacodinamica/farmacocinetica possibile sviluppo di R tossicità costi

Faringotonsillite Frequenti Rari S.Pyogenes Influenza A e B EBV Adenovirus Enterovirus Influenza A e B Parainfluenza (tipi 1-4) EBV Rari RSV Rhinovirus Coronavirus Reovirus Cytomegalovirus Rosolia T.gondii Candida sp. A.haemoyticum Frequenti S.Pyogenes Influenza A e B EBV Adenovirus Enterovirus M.pneumoniae Rari S.emolitici C e G Anaerobi N.gonorrhoeae T.pallidum Y.pseudotuberculosis

Faringotonsilliti batteriche agenti etiologici più comuni Streptococco  gruppo A Streptococco  gruppo C Streptococco  gruppo G

Faringotonsilliti batteriche Diagnosi microbiologica Prelievo Superficie tonsillare (fosse tonsillari) Superficie posteriore faringe Terapia non in atto Falsi negativi Prelievo non corretto Terapia antimicrobica in atto o pregressa

Faringotonsilliti streptococciche sistemi rapidi Specificità 95% Diagnosi rapida No terapia nei negativi Terapia immediata nei positivi < contagi <complicanze Sensibilità 80% Costo elevato In caso di negatività è indicata la coltura

Faringotonsilliti streptococciche test di sensibilità Test di sensibilità non indicato di routine Farmaco di elezione penicillina (amoxicillina,ampicillina) Cefalosporina I generazione in allergia ritardata alle penicilline Macrolide in allergia alle penicilline

Percentuale di resistenza (laboratorio di Microbiologia AOC,Firenze) anno Anno 2000 R=40,6% S=59,4% Totale stipiti 357 Anno 2001 R=49,9% S=50,1% Totale stipiti 540 Anno 2003 R=20,0% S=80,0% Totale stipiti 919

Altri microrganismi isolabili in faringe non significativi come agenti etiologici di faringotonsillite N.meningitidis Può essere di aiuto nella diagnosi di meningite Significato nella ricerca dei portatori in corso di eventi epidemici Candida sp. Significativa solo nell’immunocompromesso

Altri microrganismi isolabili in faringe non significativi come agenti etiologici di faringotonsillite H.influenzae Agente etiologico di epiglottite non di faringite Rilevazione utile solo a fini epidemiologici S.aureus Ricerca solo nel monitoraggio pre-operatorio del paziente cardiochirurgico

Altri microrganismi potenzialmente significativi se isolati in faringe N.Gonorrhoeae dati clinici esistenza di portatori in pz con gonorrea Non indicato l’antibiogramma di routine Indicato solo in pochi casi ( MIC o diffusione) Testare sempre -lattamasi se è utilizzata la penicillina in terapia

Infezioni delle vie urinarie eziologia adulti maschi femmine E. coli 63% 75% Klebsiella spp. 4% 2% Proteus spp. <1% 1% Altri g-neg 20% 16% Gram-pos. 12% 6% Da Warren J.W. 1996

Urine frequenze di isolamento laboratorio microbiologia Careggi Pazienti ricoverati 27 32 45 Gram-pos. 2 14 10 13 5 Altri gram-neg. 7 11 6 Pseudomonas spp. 3 Klebsiella spp. 12 17 Proteus spp. 53 23 37 38 E. coli ger t.int chir med ped Specie

Pazienti ambulatoriali Urine : frequenza di isolamento anno 2003 laboratorio microbiologia Careggi 58% 14% Pazienti ambulatoriali

Pazienti ambulatoriali Urine : frequenza di isolamento anno 2003 laboratorio microbiologia Careggi 7,5% 20,5% 58% 14% Pazienti ambulatoriali

Enterobatteri Cefazolina/cefalotina Ampicillina Gentamicna Ofloxacina/ norflox./ lomeflox./ cinox. Nitrofurantoina Trimethoprim - sulfametossazolo

Enterobatteri Amikacina Penicilline protette Cefuroxime/cefonicid/cefamandolo Cefepime Cefoperazone/cefotetan/cefoxitin Cefotaxime/ceftizoxima/ceftriaxone Ciprofloxacina Imipenem/meropenem Piperacillina/mezlocillina/ticarcillina Aztreonam Ceftazidime Kanamicina Netilmicina Tetracicline Tobramicina

P.aeruginosa ed altri non Enterobatteri Ceftazidime Gentamicina Piperacillina/mezlocillina/ ticarcillina Carbenicillina Ceftizoxima Norfloxacina/ofloxacina/ lomefloxacina Tetraciclina Cefepime Amikacina Aztreonamcefoperazone Imipenem/meropenem Ticarcillina-a.clavulanico Tobramicina Ciprofloxacina Sulfametossa-trimethoprim ( no piocianeo)

Enterococcus sp. Penicillina/ampicillina Vancomicina Ciprofloxacina/norfloxacina Nitrofurantoina Tetraciclina Vancomicina Tetraciclina Rifampicina

sxt = sulfameto/trimethoprim E. coli ( 2109 ) %R cef = cefazolina nit = nitofurantoina gen = gentamicina am = ampicillina cip = ciprofloxacina sxt = sulfameto/trimethoprim

am/su = ampicillina/sulbactam E. coli ( 2109 ) %R cfx = cefuroxime cro = ceftriaxone fep = cefepime ami = amikacina caz = ceftazidime atm = aztreonam am/su = ampicillina/sulbactam pip = piperacillina imi = imipenem

E. Faecalis ( 471 ) p = penicillina te = tetraciclina cip = ciprofloxacina nit = nitrofurantoina va = vancomicina

Feci : frequenza di isolamento principali patogeni ( 2003 ) 5% 1% 55% 39%

Feci : frequenza di isolamento Salmonella sp. ( 2003) 29% 40% 31%

Salmonella spp. ampicillina trimetoprim/sulfametossazolo fluorochinoloni ceftriaxone cloramfenicolo Agente etiologico di gastroenterite in genere autolimitante in cui l’uso degli antibiotici dovrebbe essere limitato ai soggetti ad alto rischio (neonati, anziani, pazienti oncologici, portatori di protesi articolari, AIDS..) La terapia dovrebbe basarsi sull’antibiogramma ; è bene ricordare che spesso prolunga lo stato di portatore. 51 72

sxt = sulfametossazolo/trimethoprim Salmonella spp. ( n° 319) % R % R am = ampicillina cro = ceftriaxone cip = ciprofloxacina caf = cloramfenicolo sxt = sulfametossazolo/trimethoprim

Salmonella spp. (n° 319) % R amp cro Cipr caf cotr S.tiphymurium 126 81 1 28 15 S.enteritidis 100 2 5 10 Altre quante 93 43 4 6 51 75

Campylobacter spp. eritromicina fluorochinoloni clindamicina aminoglucosidi amoxicillina/clavulanico tetracicline cloramfenicolo Agente etiologico di gastroenterite autolimitante, nei pazienti con sintomi protratti nel tempo il trattamento antibiotico sembra ridurre la malattia e prevenire le recidive 51 75

Feci : frequenza di isolamento Campylobacter spp. ( anno2003 ) 15% 10% 75%

amc = amoxi/a.clavulanico Campylobacter spp. (n° 235) % R %R amc = amoxi/a.clavulanico cip = ciprofloxacina cc = clindamicina e = eritromicina gm = gentamicina

Campylobacter spp. ( n° 235) % R amc cipr cc e gm C.coli 24 4 71 50 C.jejuni 176 2 54 1 Campylobacter sp 35 6 64 45 51 75

Shigella spp. ampicillina trimetoprim/sulfametossazolo fluorochinoloni Il trattamento antibiotico è indicato perché abbrevia la durata della malattia e riduce le recidive. E’opportuno eseguire l’antibiogramma a causa del crescente problema della resistenza ad ampicillina 51 73

Y.enterocolitica aminoglucosidi cloramfenicolo tetracicline cefalosporine di 3° generazione Si ricerca solo su richiesta specifica La manifestazione dissenterica non tende, in genere, a risoluzione spontanea e necessita quindi di terapia antibiotica basata sui dati di sensibilità in vitro 51 74

E.Coli O 157 H 7 Agente etiologico di diarrea ematica complicata talvolta da una sindrome uremica emorragica, si esegue solo su richiesta. Normalmente la terapia antibiotica non è indicata nelle forme non complicate Nel nostro territorio è di rarissimo isolamento

C.difficile La ricerca è giustificata solo in pazienti con colite pseudomembranosa o per quelli che sviluppano diarrea durante terapia antibiotica o chemioterapia antitumorale La coltura non ha valore diagnostico : il test di scelta è la ricerca della tossina nelle feci diarroiche Farmaci di elezione sono teicoplanina (vancomicina) , metronidazolo

Sorveglianza Conoscenza dell’epidemiologia locale Infezioni Circolazione dei possibili agenti etiologici Frequenza isolamento Resistenza ai farmaci antimicrobici Sorveglianza

Sorveglianza Analisi condotta solo su isolati provenienti da materiali rappresentativi di infezioni invasive e/o materiali altamente significativi di infezione

Sorveglianza Analisi condotta su isolati provenienti da materiali non rappresentativi di infezioni “colture di sorveglianza” Conoscenza della dinamica di circolazione dei microrganismi Possibilità di controllo modalità operative Possibilità di controllo dell’efficacia della prevenzione (VRE, A.baumannii ecc..)

Report epidemiologici impostare una terapia antibiotica ragionata prima del risultato dell’antibiogramma

Alcune importanti avvertenze sull’antibiogramma Enterococcus sp.: cefalosporine, clindamicina e co-trimossazolo non sono efficaci clinicamente Enterococcus sp.: aminoglucosidi non sono efficaci clinicamente (ad eccezione delle endocarditi in associazione con beta-lattamici o glicopeptidi previo saggio in vitro del sinergismo) Enterococcus sp.: è sempre “R” a meropenem il risultato in vitro dell’imipenem non è predittivo per il meropenem Stafilococcus sp. MRSA: beta-lattamici non sono efficaci clinicamente Stafilococcus sp.: se “S” a clindamicina ma “R” ad eritromicina, la clindamicina può non essere efficace clinicamente Se il suo uso fosse indispensabile, richiedere al laboratorio il D test MICETI : scarsa corrispondenza VITRO-VIVO

Test di sensibilità Per concludere : Non sempre utile e/o necessario CMI più bassa non significa necessariamente farmaco migliore Ricordare il concetto di equivalenza/comparabilità Conoscenza della farmacocinetica Possibile non concordanza vitro-vivo (in vitro veritas ?) Controllare congruità tra isolato ed infezione (flora residente, inquinante…)

Test di sensibilità conclusioni "In nessun caso l' antibiogramma può essere il solo criterio di scelta di un farmaco antimicrobico ma la ricerca di una intelligente applicazione del risultato può fare molto per stimolare l'acume del clinico" Petersdorf R.G. e coll. 1965