LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA LE EMOCOLTURE Patrizia PECILE LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA A.O.CAREGGI FIRENZE

EMOCOLTURA N° richieste < reale importanza diagnostica sepsi alta mortalità aumentata incidenza sepsi

DISTRIBUZIONE (%) DEI LAB DISTRIBUZIONE (%) DEI LAB. PER N° DI EMOCOLTURE ESAMINATE IN GRANDI OSPEDALI (> 400 POSTI LETTO) N° < 1500 1501- 3501- > 8.000 3500 8000 Italia (1988) * (49 Osp.) 69% 14% 10% 6% Italia (2001) (99 Osp.) 39% 23% 22% 15% USA * (98 Osp.) 8% 40% 52% * Goglio e al., Microbiologia Medica, 1992 Indagine AMCLI APSI

EMOCOLTURA Dipende in modo inusuale dal comportamento del medico curante (tecniche sterili, scelta del n°, vol., frequenza) Dipende in modo inusuale dal giudizio clinico del medico curante (stima della prob. della setticemia, stima del probabile patogeno, interpretazione del risultato)

EMOCOLTURA FASE PRE-ANALITICA FASE ANALITICA FASE POST-ANALITICA

EMOCOLTURA : risultato ottimale momento del prelievo intervallo e numero dei campioni tecniche sterili volume del prelievo caratteristiche del mezzo di coltura evidenziazione dello sviluppo interpretazione del risultato

EMOCOLTURA suggerimenti per una corretta esecuzione: prelievo Il prima possibile e prima della febbre (60-90 m) I successivi nel giro di 1 h un unico prelievo distribuito in 6 flaconi? In corso di terapia subito prima della stessa Intervalli molto lunghi per documentare una batteriemia continua

EMOCOLTURA suggerimenti per una corretta esecuzione: prelievo Un prelievo è raramente sufficiente Due-tre prelievi batteriemia batteriemia intermittente Quattro o più terapia antimicrobica pregressa terapia antimicrobica in atto se patogeno atteso è anche un comune contaminante

EMOCOLTURA suggerimenti per una corretta esecuzione: prelievo Sospetta sepsi, meningite, osteomielite, polmonite…. 2/3 prelievi distanziati circa 30’prima della terapia Febbre di origine sconosciuta 2/3 prelievi nell’arco di 1h per 3gg consecutivi

EMOCOLTURA suggerimenti per una corretta esecuzione: prelievo Sospetta endocardite acuta 1°accertamento : 3 prelievi a distanza di circa 30’prima dell’inizio della terapia antibiotica Controlli successivi : 2/3 prelievi a distanza di circa 30’al 7°-14°-28° giorno

EMOCOLTURA suggerimenti per una corretta esecuzione: prelievo Sospetta endocardite sub-acuta o cronica 3 prelievi a distanza di circa 30’prima dell’inizio della terapia antibiotica 3 prelievi a distanza di circa 30’ dopo 24h

EMOCOLTURA suggerimenti per una corretta esecuzione: prelievo Pazienti con terapia antibiotica in atto 2 prelievi a distanza di circa 30’subito prima della somministrazione antibiotica. Ripetere per 3 gg Pazienti con terapia antibiotica pregressa (1-2 settimane) 2 prelievi a distanza di circa 30’ per 3 gg consecutivi

EMOCOLTURA suggerimenti per una corretta esecuzione: prelievo Pazienti in età pediatrica 2 /3 prelievi nella giornata volume 1-5 ml

EMOCOLTURA suggerimenti per una corretta esecuzione: prelievo Disinfezione (cute, gomma del flacone) Non prelevare da catetere Prelevare da più zone

EMOCOLTURA suggerimenti per una corretta esecuzione: prelievo RELAZIONE DIRETTA VOLUME / POSITIVITA’ Almeno 10 ml nella maggior parte dei casi Bambini 1-5 ml Rapporto ottimale campione/terreno

no si

EMOCOLTURA suggerimenti per una corretta esecuzione Rapporto con il clinico Istruzioni sulla formulazione della richiesta, indicazioni principali dell’esame, modalità di routine e speciali ecc. Ottenimento delle notizie cliniche rilevanti ai fini dell’emocoltura sospetto clinico (per es. endocardite) presenza cateteri sospetto patogeno (per es.brucella) nutrizione parenterale terapia antibiotica

EMOCOLTURA suggerimenti per una corretta escuzione Tempi di incubazione Manuale almeno 7 giorni Automatico 5-7 giorni (vari autori propongono 5 giorni)

EMOCOLTURA Emocolture : tempo medio di positivizzazione Sistemi convenzionali 28% = 24 ore 77% = 48 ore Sistemi automatizzati 57% = 12 ore 82% = 24 ore Alonso C. e coll. 1996

EMOCOLTURA esigenze colturali diverse Miceti : prolungamento icubazione, flaconi specifici? Brucella sp.: prolungamento incubazione (28gg)

EMOCOLTURA esigenze colturali diverse Leptospira sp. : solo nella 1° settimana di malattia prelievo eparinato (eparina od ossalato di Na ) semina in terreno specifico incubazione T°ambiente lettura una volta a settimana per 6 settimane

EMOCOLTURA esigenze colturali diverse Borrelia sp. : prelievo eparinato semina in terreno specifico (Kelly) incubare a 35° per 6 settimane lettura ogni settimana Legionella sp. : la batteriemia non è frequente

EMOCOLTURA in caso di segni o segnali di positività PREPARATO MICROSCOPICO (gram, acrid. orange) positivo + reperto chiaro : comunicazione (se il reperto non è chiaro o non ci sentiamo abbastanza sicuri meglio non fuorviare ed attendere la coltura) semina, antibiogramma diretto

EMOCOLTURA in caso di segni o segnali di positività ANTIBIOGRAMMA DIRETTO Metodi più utilizzati manuali Evidenziare i principali meccanismi di resistenza (ESBL, METICILLINA…..) migliora assistenza e/o riduce i costi della degenza Attualmente non esistono metodi standardizzati e/o approvati

EMOCOLTURA antibiogramma diretto CC OX TEC AM AMC CAZ PIP NN CTX ATM TCC CIP SXT IPM GM

Produzione di ESBL

EMOCOLTURA in caso di segni o segnali di positività IDENTIFICAZIONE DIRETTA DEI MICRORGANISMI Attualmente non esistono metodi standardizzati e/o approvati

EMOCOLTURA in caso di segni o segnali di positività Semina : Flaconi Ag. Sangue in aerobiosi e anaerobiosi Aerobi Selettivi (DEX e CNA) e miceti (microscopia) Anaerobi Ag. Cioccolato in CO2 identificazione e antibiogramma dell’ isolato conservazione dello stipite

EMOCOLTURA Identificazione di specie secondo i metodi in uso in laboratorio allestimento prove di sensibilità secondo i metodi in uso in laboratorio

EMOCOLTURA in caso di negatività Semine cieche durante o a fine incubazione? Manuale: nel tradizionale flacone di brodo è raccomandata da alcuni Autori quella a 48 e 72 ore e finale per molti Autori non portano vantaggi (costo/beneficio) Automatico: non indicate

EMOCOLTURA interpretazione risultati : falsi positivi 30 - 50% dei positivi = falsi positivi 50% dei pazienti sottoposti ad emocoltura sono a basso rischio di batteriemia > costo / laboratorio > costo / degenza prelevare emocolture a pazienti con basso rischio di batteriemia > rischio di falsi positivi

EMOCOLTURA interpretazione risultati :come identificare i falsi positivi (aspetti clinici) Decorso clinico non tipico Non riscontrata l’infezione primaria con lo stesso isolato Assenti i fattori di rischio per batteriemia Assenza di leucocitosi o deviazione a sinistra

EMOCOLTURA interpretazione risultati : come identificare i falsi positivi (aspetti microbiologici) Positività per flora cutanea Positività per flora polimicrobica Positività tardiva

EMOCOLTURA giudizio di positività giorni di positività e positività multiple 1 giorno 2 giorni 3 giorni 4 o più giorni Più di un flacone positivo > probabilità di vera batteriemia

EMOCOLTURA interpretazione risultati : falsi negativi Terapia antimicrobica Germi "difficili" Germi con esigenze colturali diverse Micobatteri, Legionelle, Coxiella burneti, Clamidie, (Miceti), Forme L, Virus

5 % EMOCOLTURA patogeni più rari (possibili falsi negativi) Erysipelothrix Leptotrichia buccalis Borrelia burgdorferi Micobatteri 5 % Coxiella burneti Clamidie Rickettsie Gruppo HACEK Legionelle Rochalimaea henselae Gemella haemolysans NVS

EMOCOLTURA (endocardite) nutritionally variant streptococci 5 % dei viridanti emocoltura positiva per streptococchi senza successivo sviluppo sensibilità ad antibiotici

EMOCOLTURA : prove di sensibilità stafilococchi enterococchi streptococchi viridanti enterobatteri non enterobatteri anaerobi miceti

Stafilococco R Beta-lattamasi pos 90% meticillina R 60-90% Fluorochinoloni,aminoglicosidi, macrolidi,clindamicina Teicoplanina R (S.haemolyticus,S.epidermidis) Vancomicina I streptogramine/oxazolidinoni R

Enterococco E.faecium E.faecalis resistenza intrinseca: cefalosporine aminoglucosidi clindamicina, co-trimossazolo resistenza acquisita: alta R ad aminoglucosidi produzione di b-lattamasi R Vancomicina streptogramine R teicoplanina oxazolidinoni

Enterococco ed emocoltura Penicillina o ampicillina vancomicina teicoplanina gentamicina (alto dosaggio) streptomicina (alto dosaggio) Oxazolinidoni, Chinopristina- dalfopristina saggio della betalattamasi 51 58

S.pneumoniae ed emocoltura Penicillina o oxacillina (1mcg/ml) ceftriaxone imipenem vancomicina 51 64

S.pneumoniae oxacillina > 20 mm S sensibilità a penicillina sensibilità a betalattamici (am, amc, fep, ctx, cro, ipm, mem ) oxacillina <19mm MIC P CRO-CTX MEM

Ceftriaxone e cefotaxime S.pneumoniae Ceftriaxone e cefotaxime meningei non meningei S < 0,5 mcg/ml S < 1 mcg/ml I 1 mcg/ml I 2 mcg/ml R > 2 mcg/ml R > 4 mcg/ml NCCLS 2002

Streptococchi viridanti ed emocoltura Saggiare sempre penicillina o ampicillina Per penicillina, ampicillina, oxacillina non sono forniti i break-points da NCCLS per il metodo della diffusione MIC metodica indicata da NCCLS

Streptococchi viridanti la conoscenza della MIC è determinante per la scelta della terapia e della sua durata penicillina MIC > 0.25 mcg/ml ampicillina MIC > 0.5 mcg/ml può richiedere associazione con aminoglicosidi

H.influenzae ed emocoltura ampicillina ( predittiva per amoxicillina ) una cefalosporina 3°generazione meropenem cloramfenicolo 51 65

se negativa riportare come ampicillina/amoxicillina S H.influenzae beta-lattamasi TEM se negativa riportare come ampicillina/amoxicillina S 51 66

resistenza ampicillina Resistenza occasionale H.influenzae resistenza ampicillina PRODUZIONE BL Resistenza occasionale CAF Tetraciclina SXT Rifampicina 51 65

H.influenzae BNLAR R beta-lattamasi negativa ampicillina/amoxicillina amoxi/clavul., ampicillina/sulb., CG2, cefemi R 51 66

Carbapenemi, penicilline protette Enterobatteri produzione di ESBL Penicilline, cefalosporine, monobattami R Carbapenemi, penicilline protette

Miceti ed emocoltura 5 fluocitosina Amfotericina B Fluconazolo Itraconazolo Chetoconazolo NCCLS,VOL 17 n 9-1997

miceti fluconazolo <8 16-32 - >64 S S dose dipendente I R fluconazolo <8 16-32 - >64 itraconazolo <0.125 0.25-05 - >1 fluorocitosina <4 - 8-16 >32 NCCLS

miceti MIC in agar indaginosità non approvati da NCCLS No MFC Costi elevati MIC in brodo macrometodo sistema riferimento MFC indaginosità Costi elevati MIC in brodo micrometodo approvazione NCCLS facile esecuzione costi medi

miceti E test Approvato NCCLS Terreni diversi per le varie molecole No MFC Difficoltà di lettura Costi elevati Diffusione in agar No MFC Dischetti a concentrazione predefinita Terreni diversi per le varie molecole Difficoltà di lettura Costi abbastanza elevati

miceti ATB fungus Non approvato NCCLS Mancanza triazoli Mancanza valori di riferimento No MFC Concentrazione elevata per amfotericina Costi medi

Anaerobi NCCLS consiglia di eseguire l’antibiogramma isolati da emocolture in soggetti con endocardite isolati da emocolture nelle batteriemie ricorrenti artriti settiche NCCLS consiglia di eseguire l’antibiogramma 4

Anaerobi Microrganismi da sottoporre ad antibiogramma specie o generi con profilo di sensibilità variabile ( B.fragilis, il genere Clostridium tranne C.perfringens, alcuni Gram negativi ) batteri molto virulenti batteri isolati in coltura pura 4

Anaerobi Molecole da saggiare periodicamente cloramfenicolo penicillina protetta imipenem metronidazolo Molecole da saggiare abitualmente clindamicina penicillina alcune cefalosporine 9

Patogeni emergenti Microrganismi uso antibiotici Diminuizione dell’intervallo di cambiamento Aumento del numero di microrganismi

Gram positivi a resistenza intrinseca a glicopeptidi Leuconostoc sp.** Erysipelothix rhusiopathiae* Gemella haemolysans Pediococcus sp.** Lactococcus sp.** Corynebacterium jk** E.caselliflavus/** gallinarum/flavescens Streptococcus milleri* Streptococcus bovis * Possibile resistenza o resistenza intrinseca a teicoplanina e/o vancomicina

Gram positivi inusuali isolati da sangue nel policlinico di Careggi Leuconostoc sp. , Pediococcus sp Habitat vegetali,terreno Flora normale tratto GI Solo pz immunocompromessi Isolamento da sangue R teico/vancomicina possono essere sensibili a IPM,CAF,GM ,ma MICs a livelli di S intermedia per penicilline Lactococcus sp Vanco S,penicilline MS

Gram positivi inusuali isolati da sangue nel policlinico di Careggi Corynebacterium jk Setticemia,endocardit,infezioni tessuti molli Habitat pelle,mucose trattoGI Pazienti immunocompromessi R intrinseca a betalattami,aminoglucosidi, teicoplanina