Test genetici nella investigazione e commercio di specie protette La genetica e le sue applicazioni in ambito forense Bologna, 7-9 Settembre 2005 Test genetici nella investigazione su frodi alimentari e commercio di specie protette Alessandra Rampazzo Dipartimento di Biologia Università degli Studi di Padova

Analisi della variabilità animale/vegetale L’identificazione della specie di appartenenza di campioni di origine sconosciuta è di particolare interesse per indagini nel campo delle sofisticazioni alimentari e del commercio di esemplari appartenenti a specie protette.

Ci sono sostanziali differenze in una analisi forense su reperti umani ed una su reperti di origine animale/vegetale? Nell’analisi della variabilità umana e animale/vegetale, sono identici: Procedimenti di estrazione e tipizzazione Metodologie analitiche (multiplexing di marcatori microsatelliti, analisi di regioni del DNA mitocondriale) Criteri di attribuzione e/o di esclusione

APPLICAZIONI in campo animale: Identificazione di animali rapiti o trafugati Identità tra seme ed animale donatore (inseminazione artificiale) Valutazione del pedigree di campioni Discriminazione tra animale nato in cattività ed esemplare catturato in natura e contrabbandato (repressione dei traffici illegali in accordo con CITES, Convenzione sul Commercio Internazionale di Specie in via di estinzione) Repressione frodi alimentari

Analisi forense implica: Identificazione delle caratteristiche individuali (es. verificare se frammenti di tessuto rinvenuti sul luogo dell’atto di bracconaggio possano essere ricollegati a campioni di carne conservata in un freezer) Identificazione delle caratteristiche della specie e/o della popolazione di appartenenza (es. definire gli ingredienti di alimenti, identificazione di furti di organismi appartenenti a varietà vegetali o a razze animali patentate o certificate) - Identificazione di Organismi Geneticamente Modificati (OGM)

Marcatori utilizzati: Marcatori polimorfi del DNA (marcatori microsatelliti o STR) Segmenti di geni del DNA mitocondriale

PCR (Polymerase Chain Reaction)

La regione ripetuta è variabile nei diversi individui Marcatori microsatelliti Short Tandem Repeats (STRs) AATG AATG 7 ripetizioni 8 ripetizioni La regione ripetuta è variabile nei diversi individui

Riconoscimento di alleli di marcatori STR Marcatore 1 Marcatore 2 Marcatore 3

DNA mitocondriale Per le sue caratteristiche, il DNA mitocondriale è particolarmente adatto per l’analisi di campioni biologici in cui il DNA sia scarso o degradato.

Citocromo b

Allineamento di sequenze del citocromo b ottenute da soggetti appartenenti a specie diverse:

Co-amplificazione di un tratto del citocromo b e della regione D-loop gallina cavallo maiale pecora uomo uomo marcatore

DNA Barcoding COI = Cytocrome c oxidase I

Species-specific DNA Barcodes

In futuro…

Tracciabilità “Tracciabilità” significa la capacità di rintracciare e seguire un alimento, un mangime, un animale produttore di alimenti [o una sostanza] attraverso tutti gli stadi della produzione e della distribuzione. (Regolamento CE/178/2002)

Tracciabilità molecolare I metodi basati sulla tracciabilità del DNA nelle matrici alimentari sono piu’ affidabili di quelli basati sulle proteine; infatti i trattamenti industriali usati nella produzione di alimenti portano alla degradazione di proteine e DNA. Tuttavia, il DNA può ancora essere rintracciato mediante l’uso di tecniche di biologia molecolare basate sulla PCR (reazione a catena della polimerasi).

Punti critici della tracciabilità molecolare Estrazione di DNA di buona qualità ed in quantità sufficiente Caratterizzazione di marcatori e geni bersaglio più utili per il riconoscimento e l’identificazione Validazione dei metodi in condizioni e laboratori diversi

Caratteristiche dei marcatori e geni bersaglio Sono strumenti per consentire l’identificazione del materiale di origine (varietà, specie) In particolare sono marcatori molecolari specifici da usare con piattaforme tecnologicamente avanzate per la genotipizzazione qualitativa e quantitativa.

OGM (organismi geneticamente modificati) Plant biotechnology Using plant biotechnology, a single gene may be added to the strand. Desired gene Commercial variety New variety (transfers) = (only desired gene is transferred)

CONCLUSIONI L’analisi del DNA ha enormi potenzialità in genetica forense, ma esistono alcuni limiti legati principalmente alle metodologie analitiche.