Virus di Epstein-Barr C. Mengoli, 2008

Tassonomia Il virus di Epstein-Barr, EBV, è un membro delle Herpesviridae. Appartiene alla sottofamiglia Gammaherpesvirinae, genere Lymphocryptovirus. L'infezione è comune, diffusa ubiquitariamente e, in età infantile, solitamente subclinica. EBV is now the prototype of the gamma subfamily of potentially oncogenic herpesviruses. The gamma herpesvirus subfamily includes both the gamma 1, or Lymphocryptovirus (LCV), and gamma 2, or Rhadinovirus (RDV), genera. EBV is the only human LCV, and the recently discovered Kaposi's sarcoma–associated herpesvirus (KSHV) is the only human RDV

Infezione acuta e oncogenicità La mononucleosi infettiva (M.I.) con anticorpi eterofili è la manifestazione morbosa più comune (interessa soprattutto l’adolescente, il giovane adulto). La MI comprende la triade clinica costituita da febbre, linfoadenopatia, angina. Inoltre EBV provoca il linfoma di Burkitt africano e il carcinoma nasofaringeo.

Flash storico Descrizione di Filatov e Pfeiffer alla fine del 19° secolo della "febbre ghiandolare" (Drusenfieber) Descrizione di sei casi clinici di M.I. in giovani adulti (Sprunt e Evans, 1921) Downey, 1923: descrizione dettagliata dei linfociti atipici nella M.I.

Anticorpi eterofili, linfoma e virus Paul-Bunnell (1932); Davidsohn (1937): descrizione di agglutinine attive su emazie di pecora previo assorbimento dell'anticorpo eterofilo su cellule renali di cavia o eritrociti di bue. Descrizione di un linfoma insolito con predilezione di capo e collo (Burkitt, 1958) Epstein, Barr, Achong (1964): descrizione di particelle virali simili-erpetiche in colture di cellule di linfoma di Burkitt.

Aspetti virologici Simmetria icosaedrica,  = 180-200 mm, involucro complesso. Nucleocapside  = 100 nm, 162 capsomeri allineati regolarmente con il “modulo erpetico" 5:3:2. Virione costituito da numerosi polipeptidi distinguibili all'analisi SDS-PAGE. Genoma a DNA, lineare, doppio filamento, 172 kbp, 101  3 megadaltons. In vivo cresce produttivamente nelle cellule epiteliali orafaringee e nei linfociti B; ambedue i tipi di cellula hanno recettori di superficie per EBV (CD21, recettore per C3d).

Linfoma e Mononucleosi Werner e Gertrude Henle (1966, 1968): sviluppano un procedimento di IF indiretta per ricercare anticorpi anti-EBV dimostrano alti titoli anticorpali nel siero di pazienti con linfoma di Burkitt e con M.I.

Linfotropismo Il virus cresce in vitro solo nei linfociti B umani e di certi primati ; generalmente non produce effetto citopatico. A seguito dell'infezione, cellule che contengono il genoma virale si trasformano o immortalizzano. Le cellule trasformate sono positive alla ricerca degli antigeni virali in sede nucleare e alla ricerca del genoma virale mediante ibridazione DNA-DNA.

Eventi precoci I linfociti B (e certi linfociti null con recettori per il complemento) sono dotati di recettore per EBV. Nel nucleo della cellula infetta compare EBNA prima che inizi la sintesi di proteine virali. Nelle cellule trasformate alcune copie del genoma virale possono integrarsi nel DNA cellulare, benchè la maggior parte rimanga in forma libera, circolare, non integrata (episomiale).

Integrazione L'integrazione viene stimolata da mitogeni B-specifici (LPS). La cellula ospite si immortalizza sia che il virus si integrato, sia che sia episomiale, sia che si trovi in ambedue le forme.

Linee linfoblastoidi Normalmente meno del 10% delle cellule B esposte al virus forma linee continue; la cellula trasformata contiene numerose genocopie virali ; produce e/o secerne Ig. Le linee cellulari che contengono genoma di EBV si distinguono in produttrici e non produttici. Le prime contengono VCA (antigene virale capsidico) nel citoplasma, liberano virioni maturi, esprimono EA (early antigens) in presenza di 5'-bromo-deossiuridina (BUdR) o 5 -iodo, 2-deossiuridina (IUdR).

Latenza Per la maggior parte del tempo EBV rimane latente sia in vivo (nel linfociti circolanti) sia in vitro (in linee cellulari trasformate). La trasmissione parenterale è rara ma riveste importanza nel paziente trapiantato.

Epidemiologia Negli USA e nel Regno Unito prima dei 5 anni il 50% della popolazione è sieroconvertita. Nell'età adulta il 90-95% della popolazione è in possesso di anticorpi. Nei pesi tropicali e nei gruppo socio-economici inferiori gli anticorpi compaiono prima. Una seconda “ondata” di sieroconversioni si ha nel secondo decennio di vita.

Prima infezione La malattia clinicamente manifesta compare più frequentemente negli adolescenti e nelle popolazioni dove l'infezione primaria ha luogo tardivamente (fra i 15 e 24 anni). L'incidenza è uguale in uomini e donne (2 anni prima in media nella donna, all’età di 14-16 anni). Gli adolescenti e gli adulti con infezione primaria sviluppano una M.I. nel 25-70% dei casi.

Viral shedding Cariche virionali modeste sono documentabili nella faringe dei malati con M.I. (50-100% dei casi). EBV viene emesso dall'orofaringe per lunghi periodi (fino a 18 mesi) dopo la prima infezione. Il virus può essere isolato dal tampone faringeo o gargarizzato di 12-25% dei sieropositivi sani

Immunosoppressi Gli immunosoppressi emettono il virus con frequenza maggiore: pazienti con tumori solidi (27%) pazienti con HIV-1 (50%) trapiantati renali (56-70%) pazienti critici affetti da leucemie o linfomi (74-92%).

Circolazione Il virus è labile nell'ambiente esterno. Trattasi di un agente molto diffuso a bassa contagiosità che richiede contatto intimo tra virus shedder asintomatico e individuo suscettibile. Le epidemie non esistono. I malati con M.I. riportano contatti con altri pazienti affetti dalla stessa malattia solo nel 6% dei casi. La morbilità più alta si osserva nei collegi universitari e fra i militari.

Clinica Faringite, febbre, linfadenopatia. Febbre nel 90% dei casi. Malessere e cefalea sono frequenti. La faringotonsillite con impegno bilaterale delle tonsille, iperemia (con o senza essudato); frequenti le petecchie al palato. Eruzione esantematica nel 5% (90-100% se il malato prende ampicillina) Il rash può essere maculopapuloso, petecchiale, scarlattinoso, orticarioide o simile a eritema multiforme Adenopatia comune (80-90% dei casi), solitamente generalizzata, più evidente nel distretto retrocervicale. Splenomegalia nel 50% dei casi. Lieve epatite con epatomegalia (10-15% dei casi), elevazione transaminasemica (80-90%), ittero (5%).

Complicanze Rare localizzazioni d’organo risultano rappresentate da sindromi neurologiche, pericardite, miocardite, orchite.

Esantema da ampicillina Esantema da ampicillina. Colpisce soprattutto il tronco estendendosi alle estremità, spesso con sfumatura violacea e accompaganto da prurito.

Quadro ematologico della MI Più del 50% dei leucociti sono cellule mononucleate, più del 10% dei linfociti sono atipici cellule di Downey Trattasi di linfociti CD8+, soppressori/citotossici, attivati Il citoplasma ampio, basofilo, vacuolizzato, con margini talvolta “arrotolati”; il nucleo è ovale, reniforme, lobulato, con cromatina irregolare; talora sono riconoscibili nucleoli Nel complesso, il quadro ematologico periferico appare polimorfo Il midollo osseo è normale

Morte Può conseguire a malattia grave (rara), con polmonite, febbre, pancitopenia, proliferazione virale esuberante in individui apparentemente sani in precedenza La morte può anche essere causata da complicanze neurologiche, rottura di milza, complicanze ematologiche (trombocitopenia, granulocitopenia), insufficienza epatica (rarissima), miocardite, ostruzione delle vie aeree

Sindrome di Duncan EBV può svelare una immunodeficienza selettiva familiare legata al cromosoma X, la sindrome di Duncan. I maschi affetti possono morire in corso di infezione primaria (nel 40% dei casi), oppure, diversi anni anni dopo l’episodio di M.I., possono presentare: agammaflobulimenia linfoma linfocitico anemia aplastica

Complicanze ematologiche Anemia emolitica autoimmune da agglutinine fredde (solitamente anti-i). Trombocitopenia; raramente grave; possibile genesi autoimmune.

Reticoloendotelite V’è una reticoloendotelite diffusa. I linfonodi sono ingrossati, con un aumento del numero dei follicoli che appaiono ingranditi. I centri germinativi sono ingrossati; contengono blasti, istiociti e linfociti. La milza é aumentata di volume (di 2 o 3 volte) con edema capsulare e trabecolare. V’è iperplasia della polpa rossa, nella quale sono evidenti cellule blastiche pleiomorfiche; la polpa bianca è relativamente normale; sono frequenti emorragie focali, soprattutto subcapsulari.

Fegato e SNC Nel fegato sono riconoscibili alterazioni modeste con infiltrati linfo-monocitario negli spazi portali. Per quanto riguarda il sistema nervoso centrale, nei casi fatali sono stati notati segni di degenerazione neuronale, manicotti perivasali, emorragie perivascolari, iperplasia astrocitaria; l'infiltrazione mononucleare è scarsa.

Patogenesi della MI La via di penetrazione del virus è l'orofaringe. Le cellule dell'epitelio sono dotate di recettori per EBV (gli stessi che legano C3d). Studi di citoibridazione hanno dimostrato EBV DNA entro le cellule epiteliali orofaringee. Il virus infetta anche le cellule B linfocitarie orofaringee. Nel corso dei 30-50 gg di incubazione il virus si dissemina nel tessuto linforeticolare, sistemicamente.

Risposta immune La risposta immune contro i B-linfociti trasformati è umorale e cellulare. Fra gli anticorpi vi sono quelli diretti contro il virus, anti-EBV anticorpi eterofili.

Anticorpi virus-specifici La tecnica è quella dell’immunofluorescenza indiretta (nel caso di EBNA, immunofluorescenza indiretta anti-complemento). Possono essere ricercati anticorpi contro quattro principali sistemi - antigene: VCA EA/D (early antigen - diffuse component) EA/R (early antigen - restricted component) EBNA

anti-VCA IgM anti-VCA: persistono 4-8 sett., sensibili (100%) e specifici; precoci IgG anti-VCA: persistono a vita (significativi se ad alto titolo, importanza epidemiologica); precoci; gli anticorpi neutralizzanti si correlano con le IgG anti-VCA e sono indicatori di immunità

anti-EA Anti-EA/D (IgG): poco sensibili (70%) ma specifici, precoci; persistono 3-6 mesi, sono correlati con malattia severa anti-EA/R (IgG): pochissimo sensibili, malattia severa o protratta, persistono da 2 mesi a 2 anni; alti titoli nel linfoma di Burkitt africano; indice di infezione riattivata nell'immunosoppresso

anti-EBNA Anti-EBNA: compaiono tardivamente (solitamente contrassegnano la risoluzione del quadro di M.I.), persistono a vita nel 100% dei casi Gli anticorpi diretti contro antigeni solubili (fissazione del complemento) hanno il significato degli anti-EBNA

CNF: carcinoma nasofaringeo

Anticorpi eterofili

Anticorpi eterofili Presenza transitoria Agglutinano le emazie di pecora e di cavallo, emolizzano le emazie di bue. La classe immunoglobulinica è prevalentemente IgM Anticorpi eterofili con specificità Paul-Bunnell coesistono con anticorpi anti-Forssman Non v'è buona correlazione fra gravità della malattia e titolo eterofili. Il significato patogenetico è incerto

Autoanticorpi Sono anche frequenti auto-anticorpi contro piastrine neutrofili linfociti antigeni nucleari ampicillina.

Immunità cellulare Si osserva una depressione dell’immunità cellulare, con anergia cutanea, ridotta rispota blastica a mitogeni ed antigeni in vitro. La risposta immune cellulare antivirale include cellule T citotossiche specifiche e cellule natural killer. Linfociti T citotossici per linee cellulari contenentei EBV sono stati documentati in pazienti con MI.

Risoluzione Con la guarigione clinica il virus non viene eliminato, ma persiste allo stato latente, potendo riattivarsi soprattutto in corso di immunosoppressione. La MI non ricompare, comunque.

Patogenicità sperimentale La malattia non è trasmissibile all'animale. Linfomi maligni sono stati peraltro indotti in alcuni primati o in roditori neonati, ovvero immunosoppressi, inoculando linee linfoblastoidi umana contenenti EBV o EBV cell-free.

Oncogenicità L’infezione latente da EBV è associata alla generazione di linee B-linfocitarie immortalizzate Questo dimostra il potere oncogeno del virus

Latenza Dopo l’infezione primaria, i linfociti B del sangue periferico contengono EBV nella proporzione di un cellula su 105 - 106. Quando 106 - 107 linfociti del sangue periferico ottenuti da un soggetto EBV-sieropositivo sono messi in coltura in assenza di linfociti T funzionanti, è probabile che emergano linee continue B-linfocitarie contenenti EBV These cell lines are then a source of infectious EBV. Interestingly, the recovery of EBV-infected cells from such cultures in the absence of exogenously added virus can be blocked by inhibitors of virus replication or the addition of neutralizing antibody . Explantation to culture can apparently cause a rare EBV infected cell to become permissive for virus replication. The newly replicated virus can then infect other B cells in the culture, and thereby initiate a latent, immortalizing infection, whereas the in vivo latently infected cell cannot spontaneously convert to a transformation type of latent infection. Virtually all cell lines that arise from cultures of normal blood cells are EBV immortalized B LCLs.

Trasformazione e latenza Il 10% delle cellule B primarie poste in coltura in presenza di EBV si infetta e si trasforma in elemento capostipite di linea linfoblastoide La replicazione virale in queste cellule trasformate è minimale o non dimostrabile La presenza del virus è tuttavia documentata dall’espressione di antigeni caratteristici dell’infezione virale “latente” The presence of the “latent” virus in each of the infected cells can be readily detected using antibodies to any of the eight different virus proteins that are characteristically expressed in LCLs. The eight viral encoded proteins include six nuclear proteins (the EBNAs) and two integral membrane proteins (the LMPs). In this context, the virus genome is hardly inactive and the infection is latent only in the absence of lytic virus infection

Marcatori di latenza Nei B linfociti B con infezione latente, EBV esprime non soltanto 6 EBNAs e 2 LMPs, ma anche 2 piccoli RNA non poliadenilati (EBERs) e “Bam A rightward transcripts”, or BARTs. Questi prodotti genici mantengono l’infezione latente e fanno sì che linfociti B quiescenti entrino nel ciclo mitotico, iniziando una attività proliferativa continua. Latent membrane proteins EBV encoded RNA

Espressione di geni di latenza Types of EBV latent infection observed in Burkitt's lymphoma (BL) cells growing in culture (types I or III), or in nasopharyngeal carcinoma or Hodgkin's disease cells in vivo (type II). Type III latency is also characteristic of human B lymphocytes that have been infected with EBV and are proliferating as a consequence of latent EBV infection. Wp, Cp, Qp: promoters alternativi. Esiste anche una latenza 0, tipica di linfociti infetti in maniera latente, non proliferanti. All stable programs of latent gene transcription seen in EBV-infected cell lines in vitro or tumors in vivo must be consistent with maintenance of the viral genome in the proliferating cell population, that is, with continued expression of the virus genome maintenance protein EBNA1. This would not necessarily be the case were EBV to establish latency in a noncycling host cell. In this example, in principle, the virus might persist without expressing any viral antigens, as in latent alpha herpesvirus infections of neuronal cells in vivo. The analogous situation for EBV would therefore be a “Latency 0,” in which Cp/Wp, Qp, and the LMP promoters are silent and viral gene expression is limited to the noncoding EBERs, possibly accompanied by the BamHI A RNAs.

Trasformazione L’effetto sulla crescita cellulare è immediato; la maggior parte delle cellule infettate entra nel primo ciclo di sintesi del DNA entro 48-72 ore dopo l’infezione Il linfocita B con fenotipo resting è la cellula più suscettibile a subire la conversione in elemento linfoblastoide

Sindromi neoplastiche associate ad EBV

Neoplasie e sindromi linfoproliferative Linfoma di Burkitt africano: associazione con EBV nel 90% dei casi LB extra-africano: associazione nel 15% dei casi Carcinoma nasofaringeo (squamoso o indifferenziato, Cina meridionale); associazione nel 100% dei casi Altri linfomi B-linfocitari dell'immunodepresso, nell’AIDS in particolare; nell’atassia-teleangectasia Sindromi linfoproliferative policlonali nell'immunosoppresso (soprattutto nel trapiantato renale e midollare): PTLD

Genomic copies of EBV in peripheral blood lymphocytes/ml 400 800 1200 1600 200 600 1000 1400 160.000 TACROLIMUS MYCOPHENOLATE PREDNISONE CYCLOSPORIN Ig monoclonal peaks 120.000 ACUTE GVHD CHRONIC GVHD BK+HEMATURIA 80.000 Genomic copies of EBV in peripheral blood BMT lymphocytes/ml EBV DNA clearance 40.000 Plasma EBV assay First EBV detection (3500 copies/ml) (0 copies/ml) 06-Dec 13-Dec 20-Dec 27-Dec 03-Jan 10-Jan 17-Jan 24-Jan 31-Jan 07-Feb 14-Feb 21-Feb 28-Feb 07-Mar 14-Mar 21-Mar 28-Mar 04-Apr time