CAUSE PRINCIPALI DI TROMBOCITOPATIE DIFETTI DI ADESIONE: Sindrome di Bernard-Soulier Malattia di Von Willebrand II. DIFETTI DI AGGREGAZIONE: Tromboastenia di Glanzmann III. DIFETTI DI SECREZIONE: Difettiva attività di ciclo-ossigenasii (congenita; da assunzione di aspirina e altri FANS) Alterata biogenesi dei granuli (“storage pool defects”; sindrome di Chediack-Higashi) IV. DIFETTI DOVUTI A FARMACI (calcio antagonisti, anestetici, certi antibiotici)

INDAGINI FUNZIONALI NELLE PIASTRINOPATIE: Aggregometrtria Dosaggio VWF Espressione di proteine di superficie

Aggregometria ottica PLASMA NORMALE+ RISTOCETINA PLASMA NORMALE Aggregazione PLASMA NORMALE Aggregometria ottica

Test di valutazione della cascata coagulativa plasmatica

Il plasma (addizionato di sodio citrato) viene ottenuto per centrifugazione ed utilizzato per misurare il tempo necessario alla formazione del coagulo di fibrina quando al plasma del paziente si aggiungono reattivi differenti per ciascun test.

Rapporto Anticoagulante (0,5 ml) : sangue Test 1 : 9 (4,5 ml) 1 : 8 (4,0 ml) 1 : 7 (3,5 ml) 1 : 3 (1,5 ml) PT (%) 90 (12,7 sec.) 83 (13,3 sec.) 64 (15,7 sec.) 5 (148,7 sec.) PTT (sec.) 19,5 20,2 22,2 87,3 FIBRINOGENO (mg/dl) 358 340 304 208

Tempo di Protrombina (TP) Misurazione: tempo di formazione di un coagulo di fibrina da plasma ricalcificato e trattato con tromboplastina a 37°C. Refertazione: % = TP controllo normale / TP paziente x 100 RATIO = TP paziente/ TP controllo normale INR

Tempo di protrombina (PT) Misurazione: tempo di formazione di un coagulo di fibrina da plasma ricalcificato Identifica i deficit acquisiti o congeniti dei fattori VII, X, V, protrombina (II) e fibrinogeno (I). Monitoraggio della terapia anticoagulante orale con dicumarolici (INR) I dicumarolici inibiscono l’attivita’ dei fattori VII, IX, X e della protrombina. PT corto --> - privo di significato patologico PT lungo --> - epatopatia. - deficit vitamina K - CID - sindrome nefrotica - farmaci

INR = PT Standardisation ISI Patient’s PT in Seconds Mean Normal PT in Seconds INR = INR = International Normalized Ratio ISI = International Sensitivity Index The INR is calculated by the formula shown on this slide. The ISI is the International Sensitivity Index. Each thromboplastin is assigned an ISI which reflects the sensitivity of the thromboplastin to Warfarin-mediated reduction of the Vitamin K dependent clotting factors. By convention, the ISI of the reference thromboplastin is 1.0. The higher the ISI, the less sensitive the thromboplastin is to Warfarin-mediated reduction of the Vitamin K dependent clotting factors. The next two slides provide an example of how the ISI (sensitivity) of the thromboplastin influences the PT ratio (PTR) and how the resulting variability is corrected by expressing the results as an INR.

How Different Thromboplastins Influence the PT Ratio and INR Patient’s PT (Seconds) Mean Normal (Seconds) Thromboplastin reagent PTR ISI INR A 16 12 1.3 3.2 2.6 B 18 12 1.5 2.4 2.6 This slide is similar to the last one, but the results of the ISI values of the five thromboplastins and the corresponding INR values are added. It is clear that the marked variability of the PTR is normalized by expressing the results as an INR. C 21 13 1.6 2.0 2.6 D 24 11 2.2 1.2 2.6 E 38 14.5 2.6 1.0 2.6

PT si allunga per livelli di fattore Fatt. VII < 50% Fatt. V < 50% Fatt. X < 50% Fatt.II < 30% Fibrinogeno < 100 mg/dL Paraproteine Cause di errore Policitemia Prelievo difficile Provetta non riempita correttamente Contaminazione eparina Latenza fra prelievo ed esecuzione test > 2 ore

Tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT) Misurazione: tempo di formazione di un coagulo di fibrina da plasma ricalcificato e trattato con tromboplastina incompleta Refertazione: Tempo in secondi RATIO =PTT paziente/PTT controllo normale

Tempo di tromboplastina parziale attivato (aPTT) Misurazione: tempo di formazione di un coagulo di fibrina da plasma ricalcificato Identifica i deficit acquisiti o congeniti dei fattori IX, VIII, e XI Monitoraggio della terapia anticoagulante con eparina Identifica con minor sensibilita’ del PT deficit dei fattori X, V, protrombina (II) e fibrinogeno (I). aPTT corto --> - privo di significato patologico aPTT lungo --> - deficit di fattori - presenza di inibitori (anti-fattore VIII, LAC) - terapia con eparina

aPTT si allunga per livelli di fattore VIII < 50% XI < 50% IX < 30% XII < 30% Fibrinogeno < 100 mg/dL Livelli di eparina 0.15-0.2 U/mL Cause di errore Policitemia Prelievo difficile Provetta non riempita correttamente Contaminazione eparina Latenza fra prelievo ed esecuzione test > 2 ore

Meccanismi di controllo dell’emostasi: cellule endoteliali recettori di membrana (TM,EPCR) inibitori della fibrinolisi (PAI-1) inibitori circolanti sistema della proteina C / proteina S sistema fibrinolitico componente endoteliale componente plasmatica

inibitore sede di sintesi target AT-III fegato trombina, Xa Proteina C fegato Va, VIIIa Proteina S fegato proteina C

VALUTAZIONE DEGLI INIBITORI FISIOLOGICI DELLA COAGULAZIONE Metodi immunologici e funzionali Dosaggio ATIII Test di resistenza alla proteina C Variazione fisiologiche ( gravidanza) Influenze farmacologiche (es: estroprogestinici, antivitamine k) Fattori genetici (trombofilia eredofamiliare)

Real time PCR apparatus

La coagulazione Intravascolare disseminata (CID) Sequenza degli eventi: Attivazione incongrua della cascata coagulativa Consumo massivo di fattori della coagulazione Formazione di microtrombi e microtrombi Sindrome emorragica

Coagulazione Intravascolare Disseminata (CID) all’emocromo avremo calo continuo delle piastrine, anche nel giro di 30- 40 minuti!! fibrinogeno ed ANTI TROMBINA III che si consumano e si riducono velocemente; dimostrazione di monomeri di fibrina; Prodotti di degradazione del Fibrinogeno D-Dimero Tempo di Quick che si riduce; PTT che aumenta Riduzione dei fattori V = Trombina Riduzione del fattore VIII

Meccanismi di attivazione dell’emostasi La fibrinogenolisi (fDP) I prodotti di degradazione del fibrinogeno derivanti dall’azione della plasmina Attivazione della fibrinolisi Plasmina Per azione della plasmina sul fibrinogeno, si formano i prodotti di degradazione X, Y, D ed E (fibrinogenolisi). Questi possiedono attività inibente la trasformazione del fibrinogeno in fibrina. La loro presenza è indice di iperfibrinolisi (es. CID) Fibrinogeno Fibrinas FibrinaI (coagulo) fDP X, Y, D, E

Meccanismi di attivazione dell’emostasi La fibrinogenolisi (fDP) I prodotti di degradazione della fibrina derivanti dall’azione della plasmina Attivazione della fibrinolisi Per azione della plasmina sulla fibrina, si formano diversi prodotti, fra i quali il più importante è il D-Dimero. La sua presenza segnala depositi di fibrina e quindi è indice di possibile stato trombotico ed ischemico. L’attività fibrinolitica evidenziata tramite la determinazione del DD è un fenomeno riscontrabile molto precocemente, quando altri indici sono ancora compensati. E’ l’unico parametro che evidenzi la formazione di fibrina. Plasmina Fibrinogeno FibrinaI (coagulo) Fibrinas fDP (D-Dimero)

Reasons for elevated D-dimer Fibrinogen Fibrin D-dimer Increased fibrin formation Increased fibrinolysis Decreased clearance