Daniela Lippi e Maria Rita De Paolis Consiglio Nazionale delle Ricerche Corso di formazione integrata scientifica e tecnologica (A.S. 2002/03) http://usr-lazio.artov.rm.cnr.it/fiset2002/ Modulo 6: Aspetti chimico-fisici e biologici dell’ambiente "suolo" Daniela Lippi e Maria Rita De Paolis Istituto di Biologia Agroambientale e Forestale Area della Ricerca di Roma1 “Montelibretti” - lippi@ibaf.cnr.it

Calendario degli incontri del modulo 6: Aspetti chimico-fisici e biologici dell’ambiente "suolo” 1. Ecosistema suolo 06/02 Artov 2. Pedogenesi 20/02 Mlib 3. Turnover della sostanza organica nel suolo 27/02 Mlib 1. Ecosistema suolo 06/02 Artov 2. Pedogenesi 20/02 Mlib 3. Turnover della sostanza organica nel suolo 27/02 Mlib 4. Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo 06/03 Mlib 5. Ciclo dell’Azoto 13/03 Mlib 6. Ciclo del Carbonio 20/03 Mlib

4. Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo Aspetti chimico-fisici e biologici dell’ambiente "suolo" 4. Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo Parte teorica Esperienze di laboratorio  Comunità microbiche e biodiversità  Analisi microbiologica dei campioni  Identikit  Metodi di rilevamento  La rizosfera  Conta microflora totale  Cenni di fisiologia

Comunità microbiche e biodiversità 4. Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo Comunità microbiche e biodiversità La qualità del suolo dipende da Condizioni strutturali Sostanza organica (Tuttavia) …….  Aspetti fondamentali della qualità del suolo sono mantenimento e ripristino della sostanza organica, la cui formazione è un processo reversibile  Le pratiche agronomiche intensive sono responsabili della sua riduzione per l’impoverimento delle proprietà fisiche, chimiche, biologiche e di biodiversità che sono basilari per la sostenibilità dell'ecosistema, con una conseguente diminuzione della fertilità del suolo e della sua resilienza Resilienza = Capacità di recupero di un sistema ecologico, una volta passati gli elementi perturbatori

l’esistenza dell’ecosistema suolo si basa sulle comunità microbiche Tuttavia l’esistenza dell’ecosistema suolo si basa sulle comunità microbiche  Il suolo è una comunità di organismi, ricca di relazioni, nella quale la biodiversità e la funzionalità delle popolazioni sono essenziali per l’efficienza.  Una comunità ricca in biodiversità, con organismi fisiologicamente diversi, è più resistente e stabile perché può superare meglio i cambiamenti ambientali per la maggiore capacità di adattamento (in particolare i microrganismi). Adattamento fisiologico Adattamento genetico l'organismo adotta temporaneamente un diverso metabolismo si ha per mutazione genetica  più frequente,  evento raro,  avviene rapidamente,  avviene lentamente,  può essere di breve durata  è duraturo

Microrganismi del suolo: 4. Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo Identikit Microrganismi del suolo: Chi sono? Quanti sono? Dove vivono? Come vivono? Cosa fanno? Batteri Maggioritari Attinomiceti Antibiotici Funghi Micorrize Alghe Fotosintesi Protozoi Predatori

Batteri Funghi Alghe Protozoi Quanti sono? Il suolo stesso è un organismo “vivente”: In circa 10 grammi il numero può superare 9 miliardi. Batteri Numericamente più abbondanti: 106-108 per grammo Maggior numero Gram-positivi Gram + Gram - Biomassa  50% biomassa totale Funghi Biomassa è 10 volte la biomassa batterica Alghe 1% dei microrganismi Protozoi

Maggiore presenza negli strati superiori perchè: Il numero dei microrganismi si riduce con l'aumentare della profondità. Maggiore presenza negli strati superiori perchè: maggiore quantità di sostanza organica, maggiore diffusione di ossigeno, più acqua, presenza di radici: rizosfera ambiente favorevole R C 0 - Lettiera e strato organico A - Strato attivo minerali e humus B - Strato inerte minerali e poca S.O. C - Substrato pedogenetico alterato R - Roccia madre

Dove vivono? Sulla superficie delle particelle di argilla o di humus, tenacemente attaccate alle particelle stesse che sono circondate da una sottilissima pellicola d’acqua: stato di adsorbimento. A S L Sostanza organica Argilla Acqua circolante nel terreno Sabbia Ife fungine Batteri Limo Circa il 23% dei batteri vivono isolati mentre il 60% si raggruppa in microcolonie di 3-6 individui ed il resto forma colonie più numerose.

Autoctoni o indigeni Zimogeni o alloctoni Come vivono?  Le popolazioni presenti sono le più adattate alle condizioni abiotiche  L’ambiente modella la composizione delle comunità  Le popolazioni modificano la composizione dell’ambiente  La comunità è in equilibrio con l’ambiente Ampiezza ecologica - Fattore limitante - Comportamento “alimentare” Autoctoni o indigeni Zimogeni o alloctoni  Attività costante a basso livello  Rapida crescita e forte attività per brevi periodi  Utilizzano costituenti umici e residui vegetali  Decompongono sostanza organica fresca  Ben adattati e poco sensibili alle variazioni ambientali  Molto sensibili alle variazioni trofiche e ambientali  Capacità di lunga sopravvivenza  Scarsa capacità di sopravvivenza  Situazione di oligotrofia (= carestia)  Situazione di eutrofia (= banchetto)

Curve di crescita della microflora autoctona* e zimogena* del suolo Aggiunta di substrato Popolazione microbica 5 10 15 20 Tempo (giorni) Curve di crescita della microflora autoctona* e zimogena* del suolo * definizioni di Winogradsky

I microrganismi sono in grado di fare quasi tutto, meglio dei biologi o dei chimici o di tutti! (Perlman, 1979) Cosa fanno? Sono soprattutto impegnati nelle decomposizioni biologiche, attraverso le quali il carbonio immagazzinato negli organismi viventi viene ossidato a CO2  Sono responsabili delle trasformazioni biologiche nei cicli biogeochimici, nei quali viene messa in evidenza la biodiversità microbica  Sono i “fornitori ufficiali” di sali minerali, azoto, vitamine, ormoni … per le piante, dalle quali ricevono zuccheri e aminoacidi  Pertanto, esiste un habitat privilegiato nel quale si stabiliscono rapporti specifici di cooperazione tra microrganismi e piante La rizosfera

La rizosfera 4. Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo Porzione di suolo che circonda le radici, viene suddivisa in tre zone : 1) ectorizosfera = strato di suolo ad immediato contatto con le radici (pochi mm) 2) rizoplano = superficie esterna delle radici 3) endorizosfera = dalla superficie delle radici ai primi strati cellulari interni ”Rizodeposizione" = flusso di C fotosintetico, fino al 50%, dalle radici al terreno. Comprende: 1) Essudati a basso peso: zuccheri, aminoacidi, acidi organici e fenoli 2) Essudati ad alto peso: polisaccaridi, detti anche "mucillagini”, ed ectoenzimi 3) Mucigel: insieme delle mucillagini mescolate con le popolazioni microbiche del rizoplano, i loro metaboliti e particelle di suolo 4) Lisati: prodotti di lisi di cellule epidermiche senescenti

Effetto rizosfera simbiosi mutualistica = protocooperazione = Nella rizosfera la biomassa microbica raggiunge valori molto più elevati che in altre aree di suolo Effetto rizosfera Tra le radici e le popolazioni microbiche della rizosfera possono instaurarsi diverse interazioni simbiontiche: simbiosi mutualistica = associazione vantaggiosa necessaria alla sopravvivenza di entrambe le componenti protocooperazione = associazione vantaggiosa ma non necessaria simbiosi mutualistiche con batteri e funghi presenti nella rizosfera Moltissime piante e alberi ( 90%) + Leguminose + Funghi micorrizici VAM (vescicular arbuscular mycorrizhae) ECM (ectomycorrizhae) Rizobi (batteri azotofissatori)

Ciclo di infezione della micorriza arbuscolare (VAM) Il fungo fornisce acqua e sali, la pianta zuccheri Le micorrize Endo Ecto Cresce all’interno delle cellule radicali: Cresce tra le cellule radicali e sulla superficie (tutte le conifere) Tartufi e Funghi Vescicole Arbuscoli Ciclo di infezione della micorriza arbuscolare (VAM)

Cenni di fisiologia 4. Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo I batteri, dal greco "bastoncino", organismi unicellulari microscopici (1-10) costituiscono il regno dei “procarioti”  Assenza della membrana nucleare  La cellula batterica ha tre strati di rivestimento capsula esterna parete cellulare rigida membrana cellulare semipermeabile  Possono avere uno o più flagelli: strutture locomotorie lunghe e sottili  Dalla capsula esterna emergono delle estroflessioni del citoplasma (pilus): assorbono le sostanze nutritive e permettono l'ancoraggio alle superfici  Il materiale genetico è costituito da un doppio filamento di DNA circolare e da ribosomi (sintesi delle proteine) liberi nel citoplasma  Possono essere presenti i plasmidi, molecole di DNA accessorie più piccole

 Moltiplicazione cellulare:  scissione o divisione binaria (batteri)  gemmazione (lieviti)  crescita apicale (funghi)  I principali fattori fisici e chimici che determinano la riproduzione e la crescita dei microrganismi sono la temperatura, il pH e l'ossigenazione. Temperature cardinali DOT, limite di tossicità Ottimale Limite inferiore Limite superiore 35°C batteri 30°C funghi 12°C mammiferi Aerobi,  0,21 atm Anaerobi facoltativi, +/- ossigeno Acidofili  7 Psicrofili tra -5° e 30°C Microaerofili,  0,21 atm Mesofili tra 15° e 50°C Neutrofili = 7 Termofili tra 55° e 90°C Basofili  7 Anaerobi obbligati, senza ossigeno Funghi  5

Il lato artistico... …Funghi e attinomiceti Dalla Biennale di Venezia, Padiglione francese, Nov. 2002

Analisi microbiologica dei campioni 4. Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo Analisi microbiologica dei campioni  Metodi di rilevamento Il numero delle cellule microbiche nel suolo può essere determinato: 1 ml Sospensione di terreno 1 2 3 4 5 6 7 8 10-1 10-2 10-8 10-6 10-3 10-4 10-5 10-7 Tecnica del vetrino interrato Se la superficie del vetrino è pulita, non è selettiva, e agisce come le particelle minerali del suolo Metodo delle diluizioni di sospensioni di suolo Conte dirette al microscopio ottico o all’epifluorescenza o elettronico a scansione Valori in difetto Valori in eccesso

Conte dirette Colorazioni vitali Il numero dei batteri calcolato con metodi colturali è di circa 106-108 batteri per grammo di terra secca, mentre quello ottenuto per microscopia diretta è di circa 10-100 volte superiore. Conte dirette I valori sono approssimati per eccesso in quanto vengono calcolate anche le cellule morte Colorazioni vitali Permettono di distinguere le cellule ancora in grado di respirare da quelle che non metabolizzano più.

 Conta della microflora totale (batteri e funghi) TERRENO PER BATTERI (Yeast-extract agar) TERRENO PER FUNGHI Glucosio 1g K2HPO4 1g KNO3 0,5g MgSO4. 7 H2O 0,2g CaCl2 0,1g NaCl 0,1g FeCl3 0,01g Estratto di lievito 1g H2O Deionizzata 1litro pH = 6.8 prima dell'aggiunta di agar Agar 20g/l Glucosio 10g Peptone 5g KH2PO4 1g MgSO4.7H2O 0,5g  Streptomicina solfato 10 ml   Rosa Bengala 100 ml H2O Deionizzata 1litro pH = 5 prima dell'aggiunta di agar Agar 20g/l Soluzione di Streptomicina solfato 0,3 g in 100 ml di H2O   Soluzione di Rosa Bengala 0,33 g in 1 litro di H2O  Preparare le piastre ( 9cm) sotto cappa, versando in ognuna circa 20 ml di terreno.

Sospensione e serie delle diluizioni 1) Preparazione del materiale a) Preparare 500 ml di soluzione fisiologica (NaCl 9‰ in H2O deionizzata). Distribuire come al punto b e versare il rimanente in una beuta da 1000 ml, sterilizzare b) Preparare una beuta da 250 ml con 95 ml di soluzione fisiologica, alla quale si aggiungano circa 100 palline di vetro, sterilizzare c) Sterilizzare alcune provette vuote da 22mm per le diluizioni

2) Sospensione del campione e diluizioni seriali a) Prelevare 5 grammi dal campione mediato e metterli nella beuta sterile contenente la soluzione fisiologica e le palline di vetro. In questo modo si ottiene la diluizione 10-1 b) Mettere la beuta ad agitare per 15 minuti c) Distribuire sterilmente 9 ml di soluzione fisiologica in 5 provette sterili 9 ml d) Fare le diluizioni: prelevare 1 ml di soluzione dalla beuta di partenza (diluizione10-1) e metterlo in una provetta contenente 9 ml di soluzione fisiologica; procedere in successione fino ad ottenere la diluizione 10-6 1 ml 9 ml Diluizioni seriali

3) Conta su piastra a) Per i funghi, dalle diluizioni 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 prelevare sterilmente 0,1 ml, versarlo sulla piastra e spargere la coltura con un'ansa sterile b) Per i batteri, procedere allo stesso modo ma considerare le diluizioni 10-3, 10-4, 10-5; 10-6 c) Inoculare 3 piastre per ciascuna diluizione, sia per la conta dei funghi che per la conta dei batteri Aggiungere una o due piastre di controllo per ciascun terreno, inoculate con soluzione fisiologica sterile N.B. Ricordarsi di indicare su ciascuna piastra il tipo di terreno utilizzato specifico per batteri o funghi, il campione, la diluizione e la data. d) Incubare a 28°C per circa una settimana; procedere con la conta delle colonie cresciute sulle piastre inoculate e registrare i dati raccolti per la successiva elaborazione