Outline Gene Finding: Struttura ed identificazione di geni in procarioti ed eucarioti; Hidden Markov Models; Genscan; Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Premessa Dimensione del genoma umano: 3 x 109 coppie di nucleotidi Numero di geni ≈ 25.000 Percentuale di DNA codificante ≈ 1.6% Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Cosa e’? Data una sequenza di DNA non caratterizzata, trovare: Quali regioni che codificano per proteine Quale dei due filamenti della doppia elica di DNA è codificante Quale schema di lettura è usata in quest’ultimo Dove comincia e dove finisce il gene Dove sono i confini tra esoni/introni negli eucarioti Etc Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Struttura del gene Schema di lettura: ogni segmento di DNA ha 6 schemi di lettura Filamento sense: ATGGCTTACGCTTGA Reading frame #3 GGC TTA CGC TTG A.. Reading frame #1 ATG GCT TAC TGC Reading frame #2 TGG CTT ACG GA. TCAAGCGTAAGCCAT Filamento antisense: Reading frame #5 CAA GCG TAA GCC AT. Reading frame #6 AAG CGT CCA T.. Reading frame #4 TCA AGC GTA CAT Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Organizzazione del gene Un gene continuo Un gene discontinuo (esoni intervallati da introni) Gene dentro un introne di un altro gene Geni sovrapposti Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Struttura del gene procariotico 5’ ATGCTACGGATG……..TGA 3’ Regione Regolatrice Promotore Segnale di Start Segnale di Stop Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Struttura del gene Eucariotico Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Un ORF è una potenziale regione codificante per proteine. Gene Finding: ORF (Open Reading Frame) Un ORF o schema di lettura aperto è una zona compresa tra 2 segnali, uno di start e uno di stop presenti nello stesso frame. All’interno dell’ORF non sono presenti ulteriori segnali di Stop. Un ORF è una potenziale regione codificante per proteine. start stop ORF ATG segnali di stop: TAA, TGA e TAG Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Primo passo La distanza media tra due segnali di stop in una sequenza casuale di DNA è 64/3 ≈ 21 Una proteina è lunga mediamente 300 aminoacidi Se individuiamo due segnali di stop sufficientemente distanti tra loro potremmo essere in presenza di un potenziale gene Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: ORF in un gene procariotico Frame 1 Frame 2 Frame 3 ORF ? Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Per ogni frame bisogna: Gene Finding: Algoritmo Per ogni frame bisogna: Calcolare la distanza tra ogni coppia di segnali di stop consecutivi. Se sono sufficientemente distanti, si va a ricercare il primo codone di start utile. Trovato un ORF di lunghezza sufficiente, è da considerare un potenziale gene. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Frame 1 Frame 2 Frame 3 Gene Finding: ORF in un gene eucariotico Quali delle finestre che vediamo sono esoni? Quali invece sono assenze casuali di segnali di stop? Frame 1 Frame 2 Frame 3 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Procarioti vs Eucarioti Piccoli genomi 0.5 – 10·106 bp Alta densità basi codificanti (>90%) No introni Identificazione del gene relativamente semplice. Probabilità di successo ~ 99% Eucarioti: Grandi genomi 107 – 1010 bp Bassa densità basi codificanti (<50%) Struttura introni/esoni Identificazione del gene complessa, livello di accuratezza ~ 50% Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Metodo statistico Un metodo migliore per determinare regioni codificanti tiene conto delle frequenze dei codoni Un uso diverso dei codoni nella regione codificante è una caratteristica universale dei genomi Uso diseguale degli aminoacidi nelle proteine esistenti Uso diseguale di codoni sinonimi Possiamo usare queste caratteristiche per differenziare regioni codificanti e non codificanti del genoma Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Segnali di codifica Distribuzione delle frequenze di coppie di aminoacidi nelle sequenze delle proteine (shewanella). La frequenza media è del 5%. Ogni amminoacido ha delle preferenze nel precedere o seguire un altro amminoacido. Alcuni aminoacidi sono molto più frequenti di altri. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

La frequenza delle coppie di aminoacidi dipende dal genoma!!! Gene Finding: Segnali di codifica La frequenza delle coppie di aminoacidi dipende dal genoma!!! shewanella bovino Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Segnali di codifica Le preferenze degli aminoacidi si rispecchiano sulle coppie di codoni (o esanucleotidi) presenti nelle zone codificanti. Ad esempio Nel genoma umano la frequenza della sequenza “AAA AAA” è ~1% nelle regioni codificanti contro ~5% delle regioni non codificanti. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Segnali di codifica Molti esanucleotidi mostrano grosse differenze di frequenza tra zone codificanti e non codificanti. Fondamenti per rilevare regioni codificanti La frequenza delle coppie di codoni sono segnali chiave usati per identificare regioni codificanti; Tutti i programmi di gene prediction se ne avvalgono. Regioni di DNA dove sono presenti moltissimi esanucleotidi che sono risultati frequenti in regioni codificanti già appurate, sono probabilmente regioni codificanti; al contrario sono regioni non codificanti. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Modello preferenziale Per ogni esanucleotide X (es: AAA AAA), calcolare la sua frequenza in regioni codificanti (FC(X)) e non codificanti (FN(X)) Calcolare il valore della preferenza di X: P(X) = log(FC(X)/FN(X)) Proprietà P(X) vale 0 se X ha la stessa frequenza sia nelle regioni codificanti, che in quelle non codificanti. P(X) ha un valore positivo, se X compare più spesso in regioni codificanti rispetto a quelle non codificanti; più grande è la differenza più alto sarà il valore di P(X). P(X) ha un valore negativo, se X ha frequenza maggiore in regioni non codificanti; più grande è la differenza più piccolo sarà il valore di P(X). Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Modello preferenziale Esempi AAA ATT e AAA GAC hanno le seguenti frequenze FC(AAA ATT) = 1.4%, FN(AAA ATT) = 5.2% FC(AAA GAC) = 1.9%, FN(AAA GAC) = 4.8% Avremo P(AAA ATT) = log (1.4/5.2) = -0.57 P(AAA GAC) = log (1.9/4.8) = -0.40 Una regione formata solo da esanucleotidi di questo tipo, è probabilmente una regione non codificante. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Modello preferenziale Perché usiamo un modello basato su coppie di codoni ? Modelli basati su singolo codone spesso non danno abbastanza informazione per capire se siamo davvero in una regione codificante o meno. Modelli basati su triple di codoni hanno bisogno di moltissimi dati per rendere attendibile la statistica. 4*4*4 = 64 codoni 4*4*4*4*4*4 = 4,096 coppie di codoni 4*4*4*4*4*4*4*4*4= 262,144 triple di codoni Nel caso di triple di codoni avremo quindi necessità di avere almeno un numero elevatissimo di sequenze caratterizzate per popolare la matrice delle frequenze Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

a1,b1,c1,a2,b2,c2,……,anbncn,an+1bn+1cn+1 Gene Finding: Predizione di una regione codificante Un semplice modello basato sulle frequenze dei codoni: Sia fabc la frequenza con la quale il codone abc occorre in una regione codificante. Data la coding sequence a1,b1,c1,a2,b2,c2,……,anbncn,an+1bn+1cn+1 la probabilità di osservare la sequenza di n codoni nei vari frame di lettura: p1 = fa1,b1,c1 x fa2,b2,c2 x … x fan,bn,cn p2 = fb1,c1,a2 x fb2,c2,a3 x … x fbn,cn,an+1 p3 = fc1,a2,b2 x fc2,a3,b3 x … x fcn,an+1,bn+1 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Predizione di una regione codificante Denotiamo con Pi la probabilità dell’i-esimo frame di lettura come: E’ possibile utilizzare in un algoritmo per la ricerca di regioni codificanti nel modo seguente: Consideriamo finestre di size n e calcoliamo Pi per ogni punto di start; Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Predizione di una regione codificante plot di log(p/(1-p)) per i tre frame di lettura: In questo frame di lettura il gene è chiaramente riconosciuto gene Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Soglia minima Regione codificante? Dove sono i confini ? Decidiamo un valore di soglia per marcare una regione come codificante. Tale valore deve essere scelto testandolo su un training set. Deve essere tale da trovare il maggior numero di regioni codificanti ed escludere il maggior numero di regioni non codificanti. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Esone Introne Esone Gene Finding: Boundary Esoni/Introni Usando come training set, sequenze di DNA la cui suddivisione esoni/introni sia conosciuta, alliniamo tali sequenze rispetto ai due siti di splicing. Esone Introne Esone  --gaggcatcag|gtttgtagac-----------tgtgtttcag|tgcacccact-- --ccgccgctga|gtgagccgtg-----------tctattctag|gacgcgcggg-- --tgtgaattag|gtaagaggtt-----------atatctacag|atggagatca-- --ccatgaggag|gtgagtgcca-----------ttatttgcag|gtatgagacg-- Splice site Splice site Esone Introne Esone  --gaggcatcag|GTttgtagac-----------tgtgtttcAG|tgcacccact-- --ccgccgctga|GTgagccgtg-----------tctattctAG|gacgcgcggg-- --tgtgaattag|GTaagaggtt-----------atatctacAG|atggagatca-- --ccatgaggag|GTgagtgcca-----------ttatttgcAG|gtatgagacg-- Splice site Splice site Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Segnali associati con gli estremi di una regione codificante Entrambi i siti di splicing hanno particolari profili di distribuzione nell’uso dei nucleotidi Distribuzione dei nucleotidi attorno al Sito Accettore (Genoma Umano). Y75 Y72 Y78 Y79 Y77 Y80 Y66 Y85 Y84 N C68 A G G63 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 1 11,1 12,7 3,2 4,8 8,7 16,7 9,5 26,2 6,3 100 0,0 21,4 C 36,5 30,9 19,1 23,0 34,9 39,7 40,5 33,3 68,2 7,9 10,3 15,1 2,4 13,5 62,7 T 38,9 41,3 58,7 55,6 42,1 37,3 44,4 47,6 27,0 25,4 0,00 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Segnali associati con gli estremi di una regione codificante Entrambi i siti di splicing hanno particolari profili di distribuzione nell’uso dei nucleotidi Distribuzione dei nucleotidi attorno al Sito Donatore (Genoma Umano). -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 A 34,0 60,4 9,2 0,0 52,6 71,3 7,1 16,0 C 36,3 12,9 3,3 2,8 7,6 5,5 16,5 G 18,3 12,5 80,3 100 41,9 11,8 81,4 20,9 T 11,4 14,2 7,3 2,5 9,3 5,9 46,2 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Procedura per identificare i segnali Creare le matrici pesate per i siti donatori e accettori. Sommiamo le frequenze delle lettere corrispondenti nelle posizioni corrispondenti -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 A 34,0 60,4 9,2 0,0 52,6 71,3 7,1 16,0 C 36,3 12,9 3,3 2,8 7,6 5,5 16,5 G 18,3 12,5 80,3 100 41,9 11,8 81,4 20,9 T 11,4 14,2 7,3 2,5 9,3 5,9 46,2 …AAGGTAAGTGTCTCA… AAGGTAAGT:(34.0+60.4+80.3+100+100+52.6+71.3+81.4+46.2)/100= 6.262 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Procedura per identificare i segnali Creare le matrici pesate per i siti donatori e accettori. Sommiamo le frequenze delle lettere corrispondenti nelle posizioni corrispondenti -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 A 34,0 60,4 9,2 0,0 52,6 71,3 7,1 16,0 C 36,3 12,9 3,3 2,8 7,6 5,5 16,5 G 18,3 12,5 80,3 100 41,9 11,8 81,4 20,9 T 11,4 14,2 7,3 2,5 9,3 5,9 46,2 …AAGGTAAGTGTCTCA… AGTGTCTCA:(34.0+12.5+ 7.3+100+100+ 2.8+ 9.3+ 5.5+16.0)/100= 2.874 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Identificare i segnali In corrispondenza di un sito di splicing, la corrispondente funzione di score avrà un picco significativo. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Rappresentazione grafica della regione codificante di un gene eucariotico Vengono scelti tra gli esoni predetti un insieme che non causa overlapping Frame 1 Frame 2 Frame 3 Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Ulteriori segnali Segnali che identificano la trascrizione TATA-Box (25-30 basi prima dello start) presente nel 70% dei casi sito di PolyA (AATAAA oppure ATTAAA) Segnali che identificano i promotori Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Ulteriori dati statistici Distribuzione lunghezza esoni 150 bp Distribuzione lunghezza introni 60 bp Una regione ricca di G+C è indice della presenza di un gene (vale solo per i genomi degli eucarioti superiori) 50% G+C Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Modelli di Markov La probabilità di un evento dipende dagli eventi precedenti Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Probabilità di una sequenza di eventi P(Sole, Pioggia, Pioggia, Pioggia, Neve, Neve) = P(Sole) P(Pioggia | Sole) P(Pioggia | Pioggia) P(Pioggia | Pioggia) P(Neve | Pioggia) P(Neve | Neve) Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Modelli di Markov Nascosti (HMM) Quale è la sequenza meteorologica più probabile che ha generato questa sequenza di azioni? Assunzione (First order Markov chains): La probabilità di un evento dipende solo dal precedente. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Probabilità di transizione dalla regione I alla II con la sequenza TT Gene Finding: Modelli di Markov Nascosti (HMM) ESEMPIO Creiamo un modello per distinguere due regioni (per semplicità supponiamo siano presenti solo due nucleotidi) I II ATTA TTAT AAAT TAAT … TTAA TATA ATAT ATTT Probabilità di transizione dalla regione I alla II con la sequenza TT Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Modelli di Markov Nascosti (HMM) ESEMPIO A quale regione appartiene la sequenza TTAT ? Calcoliamo la probabilità di tutte le possibili sequenze di nucleotidi appartenenti alle due regioni. TITIAITI=1.1x10-1 TITIIAITI=1.8x10-3 TIITIAITI=6.0x10-3 TIITIIAITI=9.0x10-3 TITIAITII=8.8x10-3 TITIIAITII=1.4x10-4 TIITIAITII=4.8x10-4 TIITIIAITII=7.2x10-4 TITIAIITI=5.5x10-4 TITIIAIITI=1.0x10-3 TIITIAIITI=3.0x10-5 TIITIIAIITI=5.2x10-3 TITIAIITII=1.4x10-4 TITIIAIITII=8.4x10-3 TIITIAIITII=2.4x10-4 TIITIIAIITII=4.2x10-2 Risulta più probabile che la sequenza appartiene integralmente alla regione I Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Genscan http://genes.mit.edu/GENSCAN.html Il tool di gene prediction più utilizzato Presenta il miglior compromesso tra Sensibilità e Specificità (sono due misure di accuratezza) Largamente utilizzato dal Consorzio Internazionale durante il Progetto Genoma Umano Utilizza come algoritmo di base l’ Hidden Markov Model (generalizzato) Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

E0 E1 E2 I0 I1 I2 Einit Eterm Esngl P N Gene Finding: Genscan è basato su HMM http://genes.mit.edu/GENSCAN.html Le coppie di introni/esoni rappresentano i differenti modi in cui un introne può interrompere una coding sequence (dopo la 1° base, dopo la 2° o dopo la 3°) E0 E1 E2 I0 I1 I2 Esone iniziale e finale Einit Eterm 3’ UTR 5’ UTR Esngl polyA P Filamento sense N ………………….. ………………….. Filamento antisense Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Misura dell’accuratezza nella predizione Scelta una caratteristica (es: identificazione esoni) Possiamo definire i seguenti valori TP (true positive) = Numero di esoni predetti, che sono risultati veri esoni. FP (false positive) = Numero di esoni predetti che sono in realtà dei falsi. TN (true negative) = Numero di esoni falsi, identificati come tali. FN (false negative)= Numero di esoni reali, identificati come falsi. Avremo le seguenti misure Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

(Parametri calcolati a livello nucleotidico) Gene Finding: Confronto tra tool di gene predictioon (Parametri calcolati a livello nucleotidico) Coefficiente di correlazione Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Interfaccia Genscan Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Output di Genscan Inizio, Fine e lunghezza dell’ elemento calcolato Probabilità che l’elemento sia un esone Score del sito Accettore e Donatore di splicing Numerazione del Gene e dei suoi elementi Filamento sul quale viene fatta la predizione Frame del primo codone dell’elemento Score della coding sequence calcolata Score complessivo dell’esone Tipo di elemento riconosciuto Proteina predetta sulla base della CDS calcolata Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007

Gene Finding: Esempio di uso di GenScan Eseguire con Genscan la scansione del frammento di genoma di Homo sapiens >gi|2253431|gb|AF007546.1|AF007546 Utilizzare la proteina predetta da Genscan per fare un BLAST proteico (BLASTP) per vedere a cosa corrisponde la predizione fatta da Genscan. Dept. of Mathematics and Computer Science - University of Catania – Corso di Bioinformatica – 2006/2007