Ematopoiesi

Sequenza di maturazione degli eritrociti Pro-eritroblasti (Pro-normoblasti) Basofili Normoblasti Policromatofili Ortocromatofili Reticolociti Eritrociti Iniziale Intermedia Tardiva

ESAME EMOCROMOCITOMETRICO Generalità Esame di base per le patologie ematologiche In passato veniva effettuato al microscopio Al sangue è aggiunto EDTA Il risultato fornisce dati su: -conta eritrociti -formula leucocitaria, -ematocrito Ht, -MCV,volume medio degli eritrociti -MCH,contenuto Hb eritrocitario medio -MCHC,[Hb]eritrocitaria media -RDV,ampiezza della distribuzione dei volumi eritrocitari In caso di anomalie deve essere completato con esame microscopico Colorazione:May-grunwald-Giemsa(Blu di metilene,eosina,Azur II)

Esame emocromocitometrico (intervalli di riferimento) Parametro Unità Maschi Femmine Emoglobina g/dL 14.0-18.0 12.0-18.0 Ematocrito % 38-52 36-46 Eritrociti 106/mL 4.5-6.3 4.2-5.4 MCV fL 80-97 MCH pg 28-32 MCHC 32-36 RDW 11-14 Reticolociti 0.2-2 Leucociti 10³/µL 4.0-10.0 Piastrine 150-400 G. Neutrofili 60-75 G.Eosinofili 0-2 G.Basofili 0-1 Linfociti 25-35

ANEMIE Definizione: Riduzione quantità Hb circolante negli eritrociti del sangue periferico. Secondo il sistema WHO essa deve avere valori inferiori a: 11g/dl per i bambini e in gravidanza; 12g/dl per donne; 13g/dl per i maschi;

catene globiniche ε e ξ; Hb Fetale: α2 e γ2 Definizione di Emoglobina: E’ una molecola proteica deputata al trasporto dell’O2; E’ costituita da 4 catene polipeptidiche, che variano durante la vita dell’individuo,a ciascuna delle quali si lega un gruppo prostetico, l’EME,ferroprotoporfirina a cui si lega l’O2 reversibilmente. Hb embrionale: catene globiniche γ catene globiniche ε e ξ; Hb Fetale: α2 e γ2 Hb Adulta: catene globiniche α,β e δγ presente in 3 diversi tipi: Hb A(α2-β2)=96-98% Hb A2(α2-δ2)=1.8-3.5% Hb F(α2-γ2)=0.2-2%

Esami di laboratorio di routine nella diagnosi dell’anemia Esame Emocromocitometrico Striscio (sangue) periferico (esame morfologia eritrocitaria) Conteggio accurato Reticolociti Indicatori metabolismo Ferro Bilirubina LDH

Esame Emocromocitometrico Comprende: Conta globuli rossi Conta globuli bianchi e Formula leucocitaria Conta piastrine Dosaggio Hb, Ht%

Conta globuli rossi: il loro numero si esprime in multipli di 10^6/mm^3 La conta si può eseguire con: Metodi manuali tradizionali Con strumenti elettronici che si basano su due principi: Metodo dell’impedenza; Metodi ottici; Valori di riferimento: Maschio: 4.6-5.8x10^6/mm^3 Femmine:4.2-5x10^6/mm^3

Valore ematocrito (Ht%): esprime la percentuale del volume degli elementi corpuscolati (soprat.globuli rossi)sul volume totale di sangue; Valori di riferimento: Maschi: 37-54% Femmine: 33-47% Hb: si esprime in g/dl Maschi: 13-17g/dl Femmine:12-16g/dl

MCH: Hb/N.GR MCV: Ht%/n°GR MCHC(%): (Hb/Ht%)x100 L’approccio diagnostico di 1°livello si basa ancora sulle modificazioni dei parametri di Wintrobe: MCV, MCH, MCHC. MCV: Ht%/n°GR rappresenta il VOLUME CORPUSCOLARE MEDIO Valori di riferimento: 83-97fl; Consente di distinguere le anemie in :Microcitiche, Normocitiche e Macrocitiche. MCH: Hb/N.GR rappresenta il CONTENUTO EMOGLOBINICO MEDIO Valori di riferimento:27-31pg Distingue le anemie in :Ipocromiche, Normocromiche, Ipercromiche MCHC(%): (Hb/Ht%)x100 rappresenta la CONCENTRAZIONE EMOGLOBINICA ERITROCITARIA MEDIA esprime la percentuale di Hb nella massa totale dei globuli rossi

Altri parametri utili sono: RDW: indica l’eterogeneità da anisocitosi CV%=DS/MCV Valori di riferimento16% circa HDW: esprime il grado di anisocromia Valori di riferimento intorno al 29%.

Formula leucocitaria: Globuli bianchi: la conta è espressa in multipli di 10^3/mm^3(10^9/l). Nell’adulto normale il valore della conta varia tra 4.3-10*10^3/mm^3 Formula leucocitaria: Neutrofili = 35 -71% Linfociti = 20 -53% Monociti = 1 - 9% Eosinofili = 0.5 - 8% Basofili = 0 - 2%

CONTEGGIO RETICOLOCITI Reticolociti: globuli rossi giovani, immaturi che contengono residui di RNA. Possono essere dimostrati con la colorazione vitale del sangue. La conta reticolocitaria nell’adulto normale è: 0.5-1.5% e andrebbe sempre rapportata al numero dei globuli rossi. E’ oggi possibile contare i reticolociti per mezzo di citofluorimetri a flusso aggiungendo al sangue una sostanza fluorescente, l’auraminaT, che si lega alle ribonucleoproteine dei Reticolociti. La fluorescenza emessa è proporzionale al numero di reticolociti.

STRISCIO DI SANGUE L’esame microscopico dello striscio di sangue serve non solo per rendersi conto della presenza o meno nel sangue di cellule patologiche,ma anche per una dettagliata osservazione della morfologia e colorazione degli eritrociti.

Alterazioni: ANISOCITOSI: emazie di grandezza diversa

ANISOCROMIA: emazie con diversa concentrazione Hb e quindi disparità nella colorazione:

FERRO Metabolismo

Indicatori metabolismo del ferro Sideremia: valori di riferimento: 50-180μg/dl Transferrinemia plasmatica: e’ espressa come TIBC (“capacità totale di legare il ferro”) dà la misura di ferro che il plasma è in grado di legare. Valori normali : 204-360mg/dl Saturazione transferrinica(%): rapporto percentuale fra sideremia e TIBC Fe plasm.(μg/dl)x100/TIBC(μg/dl) Valori normali: 30-50% Ferritina plasmatica: è in equilibrio con la Ferritina dei depositi; ci dà un’indicazione sulle riserve di ferro che possono venire mobilizzate per la sintesi dell’Hb Valori normali: 30-300ng/ml

Bilirubina Bilirubina totale: Bilirubina diretta Bilirubina indiretta La maggior parte della bilirubina deriva dal catabolismo dell’Hb a livello delle cellule del sistema reticolo endoteliale della milza, del fegato(cell.di Kupffer) e del midollo. Parametri: Bilirubina totale: valori normali: 0.2-1.1mg/dl Metodo di misura: ”fotometria di assorbimento” in seguito copulazione con reagente di Ehrlich. Bilirubina diretta Bilirubina indiretta

LDH LATTICO DEIDROGENASI: enzima glicolisi; è ubiquitario: miocardio,globuli rossi, reni, milza, pancreas,tiroide, linfonodi, fegato e muscoli scheletrici. Presenta 5 isoenzimi: (miocardio,eritrociti,rene,polmone) LDH1(H4) LDH2(H3M) (milza, pancreas, tiroide e linfonodi) LDH3(H2M2) (fegato e muscoli scheletrici) LDH4(HM3) LDH5(M4)

Classificazione anemie In base alla causa che l’ha provocata e alla sede da cui insorge le anemie si suddividono in 4 tipi.

ANEMIA APLASTICA Diminuzione di tutti gli elementi figurati del sangue normale ipercellulare ipocellulare

Anemia 1°tipo: Aplastiche Sono anemie in cui l’alterazione primitiva è a carico del midollo eritropoietico (alterazione cellula staminale) Aplasia midollare o Anemia aplastica idiopatica (causa sconosciuta) Anemia Aplastica costituzionale di Fanconi (caratterizzata da anormalità congenite e da alterazioni cromosomiche) Anemia aplastica secondaria da: agenti fisici e chimici farmaci citotossici infez. Virali o batteriche gravidanza (per < produzione di eritropoietina)

Sostituzione e infiltrazione neoplastica del midollo osseo (leucemie e linfomi, mieloma, m.di Hodgkin; neoplasie metastatiche: Ca polmonare, prostatico, mammario) Sindromi mielodisplastiche: gruppo eterogeneo di malattie caratterizzate da disordini della cellula staminale emopoietica, che possono evolvere in LEUCEMIA ACUTA NON LINFOCITICA. Comprendono: Anemia refrattaria Anemia sideroblastica acquisita idiopatica Anemia refrattaria con eccesso di blasti Anemia refrattaria con eccesso di blasti in trasf. Leucemia Mielomonocitica cronica Una delle principali distinzioni fra queste forme è la presenza e la variabile proporzione dei BLASTI nel midollo osseo e anche nel sangue periferico.

Diagnosi di laboratorio Reperto di Pancitopenia, la cui gravità è variabile E’ un’Anemia di tipo Normocromico, Normocitico, (MCV e MCH normali) Più raramente Macrocitico ipercromica (come in sindrome mielodisplastica) per la maggiore concentrazione di Eritropoietina (è maggiore sia nel plasma che nelle urine) con elementi immaturi di tipo: Megaloblastico, anisopoichilocitosi; (perché oltre ad avere una inefficace ematopoiesi, gli eritrociti sono displastici ed alterati funzionalmente) a seconda del tipo di anemia Mielodisplastica

I Reticolociti saranno ridotti di numero Sideremia, Saturazione transferrinica, Ferritina possono essere aumentati perché il ferro non viene utilizzato. La diagnosi di certezza si basa sull’ Esame del Midollo Osseo che è povero o anche quasi privo di cellule in base alla gravità della malattia. Nelle SINDROMI MIELODISPLASTICHE il midollo si presenta Iperplastico con caratteristiche anomalie dei precursori eritroidi

Anemia 2°tipo (alterazione proliferazione e maturazione eritroblasti, minori eritrociti) Sono legate a deficit Folato, di Vitamina B12. Difetto primitivo nel metabolismo del DNA e quindi nella proliferazione e maturazione cellulare

B12 e Folati nella sintesi del DNA dUMP dTMP DNA Timidilato Sintetasi FH4 (Folati) Metil Cobalamina Cobalamina (Vitamina B12) N5 - Metil FH4

Diagnosi di laboratorio Anemia MACROCITICA IPERCROMICA per la presenza di elementi immaturi di tipo megaloblastico: c’è una sproporzione tra citoplasma e nucleo perché la sintesi di Hb avviene normalmente ma quella di DNA è ridotta. Contengono nel loro interno inclusioni basofile e residui nucleari (Corpi di Jolly) Eritrociti in periferia ridotti numericamente, varianti per forma (ovalociti) e volume. MCV > (tra 100 e 150fl) La carenza di sintesi di DNA si ripercuote anche sulle altre linee: Piastrinopenia e alterazioni funzionali Neutrofili con nucleo plurilobato con 5-6 lobi Leucocitopenia

Vivace eritropoiesi inefficace: >Bilirubina indiretta >Sideremia e Ferritina; Sideroblasti ad anello nel midollo >LDH All’aspirato midollare :il midollo è ricco e iperplastico; si oppone deficit in periferia per maggior eritropoiesi inefficace. TEST DI SCHILLING: assorbimento in 48 ore di Vit. B12 marcata ( ridotto assorbimento aumento di Vit. B 12 marcata nelle urine) Dosaggio Ac Formiminoglutamico urinario: aumenta nelle urine in caso di carenza di catabolismo dell’istidina ad opera di diminuito ac. Folico)

Anemia di 3° tipo Anemia sideropenica Sindromi talassemiche Difettosa sintesi Hb: Anemia sideropenica Sindromi talassemiche Disordini cronici (infiammazioni, infezioni, neoplasie) Anemie sideroblastiche

Anemia Sideropenica Anemia MICROCITICA IPOCROMICA (globuli rossi piccoli e pallidi) MCV <, con numero di globuli rossi normale o talvolta <. Alterazioni parametri relativi al ferro: Sideremia, Ferritina < Transferrina >

Osservazione dello striscio periferico Diafania della parte centrale dei globuli rossi (IPOCROMIA)

Eritrociti più piccoli (MICROCITOSI)

ANISOCITOSI e POICHILOCITOSI proprio perché l’eritropoiesi è anomala.

norm assente no Si(poca) Si grave si poche Si diffusa si Norm. s.prelatente s.latente a.iniziale a.grave Fe del SRE norm assente Sideremia Anemia no Si(poca) Si grave Ipo/micro si poche Si diffusa Ass. Fe si Alter.epiteliali MCV/MCHC

Alterazioni epiteliali Cute secca, anelastica, capelli sottili, fragili, radi. Unghie opache, fragili, appiattite o addirittura concave (coilonichia)

Le labbra presentano piccole ragadi alle commissure (cheilite angolare)

La mucosa orale è arrossata, la lingua liscia, levigata, pallida (glossite)

Sindromi talassemiche α-TALASSEMIE α°-talassemie:sintesi α-catene soppressa α+-talassemie: sintesi α-catene ridotta La gravità varia in base al numero di geni deleti. In ogni cromosoma aploide si trovano: Un gene β-globinico e due geni α-globinici,quindi ogni individuo possiede due geni codificanti catene β, e 4 geni codificanti catene α

Quindi le α-talassemie conseguono alla delezione di un numero variabile dei 4 geni α-globinici: Delezione un gene = Portatore silente Delezione due geni = Talassemia minor Delezione tre geni = Malattia da HbH Delezione quattro geni = Idrope fetale placentare

Zone geografiche di diffusione della α-talassemia

Le combinazioni genetiche possibili sono le seguenti:

Diagnosi di laboratorio Anemia MICROCITICA HbA2 normale o <(importante per la diagnosi differenziale con β-talassemia) Parametri relativi al metabolismo del ferro (Sideremia, Ferritina, Transferrina) per lo più normali Inoltre > resistenze osmotiche

Β-Talassemie Condizione Omozigote: (talassemia maior o morbo di Cooley) Omozigosi β°= sintesi completamente soppressa Omozigosi β+ = Sintesi ridotta Stato Eterozigote = Talassemia minor

Morbo di Cooley α2 γ2 α2 β2 Hb F Precipitazione α2 γ2 α2 β2 Hb F Precipitazione Aumento Emolisi distruzione Dell’affinità dei Per l’ossigeno precursori degli eritrociti splenomegalia eritropoiesi inefficace Ipossia tissutale Anemia Aumento della Eritropoietina trasfusioni Ipertrofia midollare accumulo di ferro Deformità aumento cirrosi Scheletriche dell’assorbimento insufficenza cardiaca di ferro alterazioni endocrine morte

I pazienti più gravi sono omozigoti:

Diagnosi di laboratorio Morbo di Cooley Anemia IPOCROMICA MICROCITICA MCV< anisopoichilocitosi ,reticolocitosi, iperbilirubinemia indiretta. Resistenze osmotiche > Elettroforesi: HbF 20-100%(marker elettroforetico) HbA < o assente HbA2 normale o >

Stato eterozigote Anemia IPOCROMICA MICROCITICA (MCH e MCV <) Elevato numero globuli rossi (poliglobulia) Elettroforesi: HbA2 (α2,δ2) è > (diagnosi certa) Parametri relativi al metabolismo ferro sono normali Resistenze osmotiche >

Anemie da disordini cronici Il ferro viene sequestrato a livello del sistema monocitico-macrofagico attivato. Sideremia bassa Transferrina < (importante per la diagnosi differenziale con anemia da carenza di ferro) Ferritina >(le riserve di ferro sono aumentate) Alla BIOPSIA MIDOLLARE: maggiore deposito ferro nei macrofagi. Inoltre trattandosi di malattie croniche su base flogistica o neoplastica VES, α2 globuline, fibrinogeno, Ig, LDH, possono essere alterati in base al tipo e al decorso della malattia.

Anemie Sideroblastiche Gruppo eterogeneo di disordini eritrocitari che presentano difettosa sintesi EME da parte degli eritroblasti. DIAGNOSI DI LABORATORIO: Anemia IPOCROMICA MICROCITICA Presenza di Sideroblasti ad anello (eritroblasti abnormi in cui il ferro non emoglobinico si distribuisce in granuli disposti ad anello in zona perinucleare) Sideremia, Saturazione Transferrinica,Ferritina >

Anemie di 4° tipo: Anemie Emolitiche La vita eritrocitaria media è accorciata rispetto al normale e l’eritropoiesi non è sufficiente a compensare la maggiore emolisi : al disotto dei venti giorni! Distinguiamo:

ANEMIE EMOLITICHE Striscio normale Sferociti Schistociti

Anemie emolitiche da causa intracorpuscolare Alterazioni membrana eritrocitaria Da deficit enzimatici Alterazioni qualitative Hb(emoglobinopatie)

TEST DI LABORATORIO SFEROCITOSI Test di RESISTENZA OSMOTICA ERITROCITARIA Test AUTOEMOLISI IN VITRO Test di LISI AL GLICEROLO

A. da deficit enzimatici Anemia da deficit glucosio 6fosfatodeidrogenasi(G6PD) Mutazione genetica trasmessa con il cromosoma X. Il G-6P D,enzima chiave del ciclo dei pentoso-fosfati è il solo mezzo per produrre NADPH nell’eritrocita,che agisce come cofattore nella riduzione del glutatione (il quale con la GLUTATIONEPEROSSIDASI elimina i composti tossici) Si avrà: < glutatione e quindi < azione riducente sui gruppi SH di Hb e dei lipidi della membrana cellulare Distruzione enzimi e denaturazione Hb con formazione corpi di Heinz accumulo idroperossidi con danni ossidativi alle proteini e lipidi di membrana Deficit enzimi via glicolitica L’ATP nel globulo rosso deriva solo da glicolisi, per cui deficit enzimatici = Anemia emolitica cronica di varia gravità

Misura attività enzimatica G6PD Test Qualitativo (NADPH fluorescent spot test) Test Quantitativo Spettrofotometrico Diagnosi molecolare con lo studio di DNA

Emoglobinopatie Emoglobinosi S (HbS) o Drepanocitosi: Alterazioni geneticamente determinate della molecola Hb. Le varianti emoglobiniche più significative sono: Emoglobinosi S (HbS) o Drepanocitosi: in posizione 6 catena β la valina prende il posto dell’acido glutamico; Le emazie appaiono rigide, non possono deformarsi e assumono l’aspetto “a falce”. Emolisi intravascolare (per l’aspetto “a falce”) Segue iperbilirubinemia indiretta, urobilinogeno fecale e urinario>. > viscosità plastica con rallentamento flusso VES < perche gli eritrociti “a falce” interferiscono con la formazione dei “rouleaux” eritrocitarie. Importante è l’elettroforesi per l’identificazione e quantificazione di HbS Resistenze osmotiche > In striscio periferico: anisopoichilocitosi più policromasia , presenza di “Cellule a Bersaglio”. Test di FALCIZZAZIONE: incubazione del sangue periferico con metabisolfito di sodioun agente ossidante, con evidenza della falcizzazione delle emazie

HbC: (acido glutamico in posizione 6 sostituito da lisina) poco solubile ma, cristalli di HbC si sciolgono e gli eritrociti si trasformano in eritrociti a bersaglio o microsferociti HbE:( in catena β la lisina sostituisce l’acido glutamico in posizione 26):< sintesi catene globiniche per cui il gene HbE determina anomalia strutturale con fenotipo Talassemico. Hb instabili Hb ad alterata affinità per l’O2 HbM

Anemie emolitiche da cause extracorpuscolari Dovute alla presenza di anticorpi anti-eritrociti: Alloanticorpi e autoanticorpi. Alloanticorpi o isoanticorpi: Ab prodotti da un individuo contro antigeni eritrocitari di soggetti di specie omologa ma geneticamente diversi dal soggetto che ha prodotto gli Ab. Naturali, presenza nel siero di Ab senza precedente immunizzazione(ab gruppo ABO per lo più IgM) Immuni: presenza Ab dopo stimolo antigenico di tipo IgG( più noti anticorpi anti-RH.) (in seguito a: trasfusione sangue incompatibile, incompatibilità materno-fetale: Malattia Emolitica del Neonato)

Autoanticorpi:Ab prodotti da un individuo contro determinanti antigenici dei suoi stessi globuli rossi Auto Ab Caldi:presentano optimum attività a 37°C. 90%sono IgG (Ab Incompleti che non sono in grado da soli di produrre agglutinazione, ma necessitano dell’aggiunta di altre sostanze.) Auto Ab Freddi (crioagglutinine): presentano optimum attività a 4°C e comunque agiscono a temperatura < rispetto quella corporea, perchè il potere agglutinante diminuisce con l’aumentare della temperatura. Sono di tipo IgM (Ab Completi in grado di provocare agglutinazione)

Avremo: Anemie Emolitiche autoimmuni da Ab caldi. Anemie emolitiche da auto Ab freddi. Emoglobinuria parossistica da freddo: rara forma di anemia emolitica autoimmune con crisi di emolisi acute in seguito all’esposizione al freddo. Ab è l’emolisina di Landsteiner

Anemie emolitiche non immunologiche Anemia emolitica da marcia Anemia emolitica da cause cardiache: (protesi valvolari, difetti intracardiaci, stenosi valvolare aortica)in questi casi si ha flusso ematico turbolento e danno meccanico alle emazie = emolisi. Anemia emolitica con depositi di fibrina: caratterizzata da emolisi quando gli eritrociti urtano contro la fibrina depositata nei vasi. Anemia emolitica nelle infezioni: Bartonellosi (il batterio aderisce alla membrana eritrocitaria) Malaria (plasmadio entra direttamente nel globulo rosso) Inoltre : Veleno di serpente Puntura di insetti Metalli Temperatura > 47-49°C

Diagnosi di laboratorio in A. Emolitiche Reticolocitosi Iperbilirubinemia indiretta urobilinogeno urinario e fecale Ipersideremia aptoglobina emopessina Presenza di Metaemalbumina Emoglobinemia ed emoglobinuria LDH Test di COOMBS